沙门菌是常见的肠道病原菌,作为肠杆菌科的一个重要菌属,型别繁多,在自然界分布广泛,存活力较强,不仅感染人畜还可污染食物,如果从事食品、公共场所从业人员感染或携带沙门菌，更有机会造成食物和环境的污染,成为重要的传染源。本研究选择2005 - 2011年杭州市下城区食品、公共场所从业人员健康体检中沙门菌检出数量最多的山夫登堡沙门菌共89株，采用脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis，PFGE)分子分型技术，分析同一血清型沙门菌分子生物学水平的异同，通过同源性分析，了解菌株间的亲缘关系，寻找辖区健康携带山夫登堡沙门菌传染源，进而为食源性疾病的快速反应、预警、监测和控制提供技术支撑，初步建立了杭州市山夫登堡沙门菌PFGE基因数据库。
1.1 材料

1.1.1 菌株的来源
　　89株山夫登堡沙门菌分离自杭州市下城区2005年1月至2011年12月饮食、公共场所从业人员健康体检、并经ATB细菌鉴定和药敏测试仪鉴定、沙门菌分型血清确认，血清抗原模式均符合 1,3,9；g, ,t；-，完成上述鉴定后, 用磁珠保存于-70 ℃冰箱中。
1.1.2 培养基和试剂
　　SC增菌液、SS琼脂、营养琼脂、M-H 琼脂、肠杆菌双支糖管Ⅰ和Ⅱ、抗生素药敏纸片均由杭州微生物试剂有限公司生产，ID32E 肠杆菌鉴定条法国生物梅里埃公司生产、沙门菌诊断血清由日本生研和成都生物制品研究所生产。蛋白酶K(Merck，Germany)，限制性内切酶XbaⅠ 150 U (TaKaRa)，低熔点琼脂糖Seakem Gold Agarose (Cambraex Big Science Rockland Inc.USA)、 十二烷基磺酸钠(SDS)(AMRESCO，USA)、细胞悬浮缓冲液CSB 、细胞裂解缓冲液CLB (50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA,pH 8.0)、1% Sarcosyl、TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 由中心实验室自配，以上所有试剂均经质控鉴定合格，在有效期内使用。
1.1.3 主要实验仪器
　　ATB细菌鉴定和药敏分析仪、浊度仪(Densimat bioMerieux France)， 脉冲场凝胶电泳仪及配套设备(CHEF Mapper, 美国Bio-Rad), 凝胶成像系统(Gel Doc2000，美国Bio-Rad)，BioNumerics 5.1 分析软件(美国Applied Maths)。
1.2 实验方法

1.2.1 药敏试验
　　选用氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、先锋必素、头孢氨噻肟、庆大霉素、妥布霉素、氧氟沙星、丙氟哌酸、阿莫西林/棒酸、复方新诺明、丁胺卡那霉素11种常用抗生素敏感试验纸片，按1997年世界卫生组织(WHO) 推荐的改良K-B法进行操作，结果判读参照美国临床实验室标准化协会(CLSI/NCCLS)制定的药敏试验执行标准(2007 年版) ^[1]。大肠埃希菌ACTT25922、ACTT35218，金黄色葡萄球菌ATCC25923，绿脓假单胞菌ATCC27853购自中国药品生物制品检定所。
1.2.2 PFGE 电泳及结果分析

1.2.2.1 细菌培养
　　取1粒沙门菌保菌磁珠于肉汤中复苏8 h,分离SS琼脂,(36±1)℃培养20 h,挑取典型沙门菌的单个菌落，接种于营养琼脂平板上过夜。采用沙门菌Braenderup血清型全球参考菌株H9812为标准相对分子质量,标准菌株的所有操作与实验菌株相同。
1.2.2.2 胶块的制备
　　用棉签刮取新鲜菌落，用浊度仪测菌液浊度至4.2 McF。取该菌液400 μl到1.5 ml离心管预热至37 ℃,加入蛋白酶K 20 μl及54 ℃预热的含1% SDS的1%低熔点琼脂糖400 μl,混合均匀后注模，制成胶块。
1.2.2.3 细胞的裂解
　　打开模具,将制好的琼脂模块置于5 ml含0.1 mg/ml蛋白酶K的细胞裂解液CLB混合液, 54 ℃水浴摇床中振荡孵育2 h以上。
1.2.2.4 胶块的洗涤
　　取出琼脂模块用50 ℃纯水摇床中反复清洗2次,每次15 min，再用15 ml 54 ℃预热TE，摇床中反复清洗4次,每次15 min。清洗好的琼脂模块浸泡于TE中, 4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2.5 胶块DNA酶切
　　取琼脂模块切成2 mm 样品胶块,浸入200 μl酶切体系中(含XbaⅠ酶3 μl)，37 ℃水浴作用4 h以上。
1.2.2.6 加样和电泳
　　将酶切后的样品胶块置于制胶模具上，缓慢倒入冷至60 ℃的1%琼脂糖,冷却20 min 后, 进行PFGE。电泳条件： 电压6 V/cm,脉冲参数2.16～63.8 s, 电泳温度14 ℃,电泳时间18 h。使用沙门菌H9812作为电泳阳性参照(Marker)，15孔模具中放4个,分别位于1、6、11、15泳道。
1.2.2 7 染色、脱色和成像
　　电泳结束后,取出胶块,用1 ∶ 10 000的溴化乙锭溶液染色30 min,用纯水脱色5 h 以上(中途更换纯水数次)。放入GelDoc2000凝胶成像分析系统中，在读胶中成像，并转换成TIEF图像格式保存。
1.2.2.8 结果分析
　　采用Quantity One^TM软件摄取PFGE结果图谱,用BioNumerics 5.1 分析软件UPGMA (Unweighted pair group method using arithmetic averages)方法进行聚类分析,条带位置差异容许度选择1.0%,优化值选择0.5%, 使用Band based/Dice方法计算不同菌株电泳条带的相似性系数,即Dice系数(F×100%,F value×100%)来衡量PFGE带型之间的相似度。F=2nxy/(nx + ny),nx表示菌株x的总的片段数, ny表示菌株y的总的片段数, nxy表示菌株x和菌株y的相同的片段数，F值反映的是不同菌株电泳条带的相似性程度,范围在0～1.000之间, 0代表完全不相关, 1.000代表完全相同^[2]。
2.1 抗生素药敏实验结果
　　89株山夫登堡沙门菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、先锋必素、头孢氨噻肟、庆大霉素、妥布霉素、氧氟沙星、丙氟哌酸、复方新诺明、阿莫西林/棒酸这10种抗生素的敏感率都比较高，达92.59%以上，11种抗生素敏感性从高到低依次为丙氟哌酸、先锋必素、头孢氨噻肟、妥布霉素、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/棒酸、庆大霉素、氧氟沙星、氨苄西林，复方新诺明、丁胺卡那霉素。其中丙氟哌酸敏感性最高达100%，丁胺卡那霉素敏感性最低为85.19%。
2.2 PFGE 分型结果

2.2.1　　89株山夫登堡沙门菌DNA全基因组经过限制性内切酶XbaⅠ酶切后, 进行PFGE，DNA片段可得到较好分离，分型率为100%。每株菌约产生12～18条清晰电泳带，酶切片段分子量在20.5~1135 kb之间，山夫登堡沙门菌部分菌株PFGE图谱见图1。


  

图1 山夫登堡沙门菌代表性菌株PFGE图谱
Figure 1 PFGE patterns of representative strains of S. senftenberg
注：M：DNA标准；1～11：各年度部分山夫登堡沙门菌。


2.2.2 聚类分析
　　用BioNumerics 5.1软件分析可见，89株山夫登堡沙门菌的相似度在61.6%～100%。按相似度100%来分，可分成48个不同的PFGE带型，分别是X₈₅1 2种PFGE带型，X₈₅2 29种带型，X₈₅3 3种带型，X₈₅4 5种带型，X₈₅5 3种带型，X₈₅6 2种带型，0769、0855、0517、0626各1种带型。按相似度95%分，可分成33个不同的PFGE带型；按相似度90%分，可分成19个不同的PFGE带型；按相似度85%分，可分成10个不同的PFGE带型，89株山夫登堡沙门菌聚类分析见图2。
PFGE指纹图分析显示，85株山夫登堡沙门菌集中分布于6个各自相似性都≥85%以上的簇内，用X₈₅1～X₈₅6表示6个簇，每个簇使用X₈₅N表示，X代表XbaⅠ酶切, 85代表相似性≥85%, N代表在图2聚类分析结果中簇的顺序。85株菌具体分布是，X₈₅2簇内分布最集中，共有68株，占总菌株的76.4%(68/89)，各菌株间彼此仅1~2个条带不同，带型之间的相似度100%~85%之间；余17株分布在其他5个相似性在100%~85.8%之间的簇内，分别是X₈₅ 1簇2株，占总株数2.25%(2/89)，2株仅有1个条带差别，相似度为96.6%；X₈₅3簇内3株，占3.37%(3/89)，菌株间仅有1~2个条带不同，带型间相似度在93.3%~90.0%之间；X₈₅ 4簇内7株，占7.87%(7/89)，各菌株间彼此有1~3个 条带不同， 带型之间的相似度在100%~85.8%之 间；X₈₅ 5簇内3株，菌株间有1~3个条带不同，带型之间的相似度93.8%~88.9%之间；X₈₅6簇2株， 占总株数2.25%(2/89)，菌株间仅有1个条带差

图2 89株山夫登堡沙门菌聚类分析图
Figure 2 Cluster analysis of 89 strains of S. senftenberg
注：0535表示2005年分离的第35株山夫登堡沙门菌，余类推。
别，相似度91.4%。X₈₅1～X₈₅6这6个簇间相似度分别是：X₈₅2与X₈₅3间相似度84.3%；X₈₅ 3与X₈₅ 4相似度87.6%；X₈₅ 4与X₈₅ 5相似度84.7%，而X₈₅ 1、X₈₅6这2簇与X₈₅ 2～X₈₅ 5这4簇间亲缘关系略远些。结果显示X₈₅1～X₈₅6簇内共85株沙门菌，有81株集中分布在相似度>82.6%的X₈₅2～X₈₅5簇内，余下X₈₅ 1簇2株相似度96.6%，X₈₅6簇2株相似度91.4%。X₈₅1～X₈₅6这6个簇之外编号 0626、0517、0769、0855共4株山夫登堡沙门菌各自相对独立，与X₈₅1～X₈₅6各簇亲缘关系比较远，相似度在81.9%~60.6%之间。
在我国山夫登堡沙门菌是引起沙门菌食源性疾病的常见血清型，笔者对杭州市下城区10年间饮食、公共场所从业人员肠道沙门菌携带状况调查分析显示，山夫登堡沙门菌位居该区沙门菌健康带菌首位^[3]。为从分子生物学角度探究该血清型沙门菌的分子型别及其聚类关系，寻找沙门菌的污染源，确定各带菌者间的病原学关系，作者将2005 - 2011年辖区内食品、公共场所从业人员健康体检中分离的89株山夫登堡沙门菌采用标准的PulseNet分子分型方案进行PFGE分子分型，结果显示所有菌株均产生12～18条清晰电泳带，PFGE分型能力很好，分型率100%。如果89株山夫登堡沙门菌按照相似度100%分析，共分成48个不同的PFGE带型，显示该区山夫登堡沙门菌PFGE带型有散在多态性，未发现绝对优势带型，可能与这些菌株均从健康人群中分离，而非暴发型株有一定关系。同时也表明PFGE这种分型方法能够显示出菌株间微小的差异，区分能力极强，是研究沙门菌分子流行病学较好的基因分型方法。
根据1995年Tenover等^[4]提出的菌株同源性判别标准,PFGE显示的DNA条带完全一致，则菌株为同源，流行病学上认为它们为相同事件，但由于细菌基因的高度变异性，判断是否为同一菌株允许有一定的变异存在，他们认为当有1～3条带的差别时，菌株间只有单基因的改变，如点突变、插入或DNA缺失，菌株为同一克隆，在流行病学上认为它们密切相关，菌株间存在非常近的亲缘关系；4～6条带的差别时，可认为同一克隆下的不同亚型，为有2个独立基因的差异，认为菌株间有存在亲缘关系的可能；有6条以上不同条带的菌株，为不同克隆，有3个或更多基因的变化,流行病学上认为无关联，既菌株间不存在亲缘关系。按照Tenover等^[4]用相似度进行同源性分析的解释，认为相似度≥85%，菌株是高度同源,可能来自同一克隆株，即成流行相关性；相似度≤50%的菌株被认为是流行病学不相关，相似度介于两者之间被认为相似菌株。依据上述文献判断标准，2005 - 2011年杭州市下城区食品、公共场所从业人员中分离的89株山夫登堡沙门菌，可能有10个克隆株存在，81株分属4个克隆株，落在X₈₅ 2～X₈₅ 5这4个相似度较高，亲缘关系较近簇内，可以认为这4个克隆株为流行的主要克隆株。值得关注的是，在X₈₅ 2簇克隆株内集中有68株沙门菌，29种不同的带型，可见X₈₅ 2簇克隆株是下城区山夫登堡沙门菌健康带菌者最常见克隆株类型，这29种分子带型为优势带型。通过对89株山夫登堡沙门菌PFGE分子型别分析研究，可以认为下城区饮食、公共场所从业人员山夫登堡沙门菌株虽有散在多态性，但它们相关性仍是比较紧密，具有明显的克隆株优势带型存在。
作者从菌株分离的时间分析，89株沙门菌为不同的年份和季节检得，PFGE结果显示,不同年份菌株有相同PFGE带型出现，但未发现有明显优势带型菌株存在，相同年份菌株仅少数菌株呈相似度为100%，大多菌株PFGE带型呈散在分布，没有呈现每年不同的流行趋势，各年分布无明显规律性。
89株山夫登堡沙门菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、先锋必素、头孢氨噻肟、庆大霉素、妥布霉素、氧氟沙星、丙氟哌酸、复方新诺明、阿莫西林/棒酸10种抗生素的敏感率都比较高，达92.59%以上，可能与这些菌株全部从健康人群中分离有很大的关系，可见细菌对抗生素的敏感性与药物在临床使用时间长短有较大的关联。

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