疾病监测, 2012, 27(10): 802-804
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2012.10.014
Serological and etiological surveillance of plague in Yiwu, Zhejiang, 2006-2011
CHEN Jin-hua1, SHI Guo-xiang2, WENG Zheng-jun1, ZHU Zhi-hong1, FU Tao1, LUO Shu-ying1
Yiwu Center for Disease Control and Prevention, Yiwu 322000, Zhejiang, China
Abstract
Objective To understand the distribution of host animals and vectors of plague in historic plague focus in Yiwu, Zhejiang province, and provide evidence for the development of local plague prevention and control strategies. Methods Plague pathogen isolation and indirect hemagglutination assay (IHA) were conducted, caf1 and pla, the specific genes of Yersinia pestis, were detected by polymerase chain reaction (PCR). Results From 2006 to 2011, 4207 serum samples collected from roden-like animals were detected and the IHA results were all were negative. No plague pathogen was isolated from 4592 liver samples and 4592 spleen samples of rodent-like animals and 115 flea samples taken from rats. The PCR detection results of caf1 and pla genes in 931 rodent-like animal organs and 115 flea samples were negative too. Conclusion No sign of rat plague was found in the historic plague focus in Yiwu, but it is still necessary to continue the surveillance of plague there.
Keywords:    indirect hemagglutination assay   F1 antibody   Yersinia pestis   specific gene   historic plague focus  

2006-2011年浙江省义乌市鼠疫血清学和病原学动态监测
陈劲华1, 石国祥2, 翁正军1, 朱志宏1, 傅涛1, 骆淑英1
1. 义乌市疾病预防控制中心, 浙江 义乌 322000;
2. 浙江省疾病预防控制中心
摘要
目的 对浙江省义乌市鼠疫历史疫源地宿主和媒介实施鼠疫血清学、病原学及分子生物学动态监测,为制定本地区的鼠疫防控策略提供技术参考。 方法 鼠疫间接血球凝集试验(IHA),鼠疫菌分离培养,聚合酶链反应(PCR)检测鼠疫菌caf1和pla特异性基因。 结果 2006-2011年,共采集鼠形动物血清4207份,IHA检测均呈阴性;动物脏器肝、脾标本各4592份,鼠体蚤115匹,未分离到鼠疫菌;鼠疫菌caf1和pla特异性基因检测931只鼠形动物脏器和115匹鼠体蚤标本结果均呈阴性。 结论 当前义乌市鼠疫历史疫源地未发现鼠间鼠疫疫情迹象。鼠疫监测工作应当进一步深入开展。
关键词:    间接血球凝集试验   F1抗体   鼠疫菌   特异性基因   鼠疫历史疫源地  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 监测要求
1.2 标本来源
1.3 主要试剂与仪器设备
1.4 血清学检测
1.5 病原学检测
1.6 多重聚合酶链反应
1.6.1 模板制备
1.6.2 扩增方法
1.7 统计学分析
2 结果
2.1 血清学检测
2.2 病原学检测
2.3 鼠疫菌caf1和pla特异性基因检测
3 讨论
　　浙江省义乌市属于输入型的鼠疫疫源地，是鼠疫细菌战侵袭地区之一。鼠疫流行始于1941年，终于1944年，为时4年。建国以来，当地政府为此做了大量深入细致的调查研究和防治工作。自1951-1963年，每年开展灭鼠、灭蚤工作，并且组织技术人员对疫区进行大量的捕鼠、检蚤等监测工作，均未分离到鼠疫菌。1951-1965年，在所属疫区及其外围地区开展了鼠疫菌苗的广泛预防接种。由于采取了以上各项监测和预防、控制措施，及时控制了鼠间和人间鼠疫疫情。自20世纪80年代中期以来，我国家鼠型鼠疫疫情在经历较长的静息期之后，重新出现了流行和扩大蔓延趋势[1]，为及时发现义乌市鼠疫疫情的异常迹象，我们对当地历史疫源地的宿主动物、媒介实施了鼠疫血清学、病原及分子生物学动态监测。现将监测的结果报告如下。
1 材料与方法

1.1 监测要求
　　2006 - 2011年，按照《浙江省鼠疫监测实施方案》中一类监测单位的要求实施监测工作。义乌市监测点每年承担的≥500 只鼠细菌分离培养和≥600 份鼠血清的F1 抗体检测工作，并尽量收集鼠体蚤进行细菌分离培养。针对义乌市疾病预防控制中心(CDC)现有的实验室条件，于每年6-7月开展鼠疫菌特异性基因检测。
1.2 标本来源
　　2006 - 2011年，每年3-11月，对义乌市鼠疫历史疫源地大陈镇的楂林进行固定监测，每年2、4、6、8月对稠江街道的江湾以及城西街道的东河进行流动监测。共捕获鼠形动物4592只，检获鼠体蚤115匹；采集鼠形动物血清4207份，脏器肝、脾标本各4592份。
1.3 主要试剂与仪器设备
　　鼠疫F1抗体间接血凝试剂和赫氏培养基由中国CDC鼠疫布病防治基地提供；caf1和pla特异性基因引物、内部对照及阳性对照鼠疫菌疫苗株(EV)模板由浙江省CDC微生物所提供，反应体系试剂由宝生物工程(大连)有限公司提供，仪器采用BIO-RAD基因扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪。
1.4  血清学检测
　　采集鼠股动脉血，分离血清于低温冰箱冷冻保存，采用IHA微量法检测鼠疫 F1抗体。
1.5 病原学检测
　　用无菌剪刀取鼠类宿主动物肝、脾各小块，用新鲜切面压印于培养基中划线培养，观察有无可疑菌落。同时，所收集到的动物体外寄生物(蚤类)按同一寄主、同一蚤种同一地点分组进行鼠疫菌分离培养。
1.6 多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,mPCR)
　　检测鼠疫菌特异性基因。
1.6.1 模板制备
　　将采集的动物脏器肝、脾标本置于无菌玻璃研磨器中，加等体积蒸馏水，研磨制成匀浆，然后置于1.5 ml微型离心管中，封闭管口，置沸水浴中加热10 min，5000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR扩增的DNA模板。
1.6.2  扩增方法1[2]
　　2006年采集制备的DNA模板并加入阳性对照EV模板，在同一扩增体系中进行PCR扩增。扩增反应总体积为30 μl。PCR-mix 3 μl (100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50 mmol/L KCl，0.1％ BSA，20 mmol/L MgC12，配对引物各0.1 μmol/L，100 μmol/L dNTPs)，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 2 μl，灭菌去离子水补齐至30 μl。反应条件：95 ℃预变性5 min，然后进入94 ℃ 40 s，58 ℃ 60 s， 72 ℃ 90 s共30个循环。最后72 ℃延伸5 min。
1.6.3 扩增方法2[3]
　　2007 - 2011年采集制备的DNA模板并加入内部对照和阳性对照EV模板，在同一扩增体系中进行PCR扩增。反应体系：buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，引物各2 μl，模板2 μl，Taq酶1 μl，加水至总体积25 μl。反应条件：预变性95 ℃ 5 min，1个循环，然后95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；30个循环。最后72 ℃ 延伸5 min。
1.6.4 产物分析
　　将扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统分析结果。
1.7 统计学分析
　　采用SPSS 17.0软件进行统计分析。
2 结果

2.1 血清学检测
　　2006 - 2011年，共采集鼠形动物血清4207份，IHA微量法检测鼠疫F1抗体均呈阴性，见表1。
2.2 病原学检测
　　2006 - 2011年共捕获鼠形动物4592只，采集鼠脏器肝、脾标本各4592份进行鼠疫菌培养，未检出鼠疫菌，见表2。2006 - 2011年检获鼠体蚤115匹，未检出鼠疫菌，其中89.57%的鼠体蚤在2006、2007年检获。

2.3 鼠疫菌caf1和pla特异性基因检测
　　2006年，采用方法1对78只鼠形动物的肝、脾标本和51匹鼠体蚤进行鼠疫菌caf1、 pla特异性基因的PCR检

表1 2006 - 2011年义乌市鼠形动物血清样本数量及来源
Table 1 Species specific serum sample number of rodent-like animals in Yiwu,2006 - 2011
年份黑腹绒鼠黑线姬鼠褐家鼠黄胸鼠针毛鼠黄毛鼠小家鼠东方田鼠社鼠臭鼩鼱白腹巨鼠巢鼠合计
20062655821612629013237625795
20072051452009324128023260727
2008228881645541217123630637
2009215173104622306202311610
201032212513510022110011134734
2011263113167119936012120704
合计149870298655514818605919917104207




表2 2006 - 2011年义乌市鼠形动物肝、脾标本细菌分离培养数(以鼠只数为单位)
Table 2 Species specific number of rodent-like animals used in Y. pestis isolation,2006 - 2011
年份黑腹绒鼠黑线姬鼠褐家鼠黄胸鼠针毛鼠黄毛鼠小家鼠东方田鼠社鼠臭鼩鼱白腹巨鼠巢鼠合计
20063016422212932016339025867
2007232176227100251911324760848
2008240901685641218123730658
2009225180105622406202511631
201037213813810325211011234809
20113001251731219613012920779
合计1670773103357115629759924017104592


测，未扩增出目标基因片段；2007 - 2011年，采用方法2对853只鼠形动物的肝、脾标本和64匹鼠体蚤进行鼠疫菌caf1、pla特异性基因的PCR检测，未扩增出目标基因片段，见表3。

表3 2006 - 2011年义乌市鼠形动物肝、脾标本PCR检测数(以鼠只数为单位)
Table 3 Species specific number of rodent-like animals used in PCR detection
年份黑腹
绒鼠		黑线
姬鼠		褐家鼠黄胸鼠针毛鼠黄毛鼠小家鼠东方
田鼠		社鼠臭鼩鼱白腹
巨鼠		合计
200662711500110078
20071446113210111051239
2008151237315201061209
20098745606000060150
201010040513000010150
20117526400000000105
合计619202367393131182931


3 讨论

义乌市是日军细菌战导致鼠疫流行的地区之一，使历史上从来没有鼠疫流行地区变成人为的鼠疫疫源地，引起了人间及动物间的鼠疫流行。通过对这一地区长期的鼠疫监测工作显示：1951-1963年的12年间，在鼠疫监测检验中，未检出鼠疫阳性标本。 从1989年开始采用放射免疫测定法(RIA)代替IHA微量法筛选检测鼠疫F1抗体后，不断有F1抗体阳性的标本被检出。但是这些阳性标本经IHA微量法进行复判，结果均呈阴性[4]。至2005年7月，用IHA微量法首次在义乌市楂林监测点采集的鼠形动物血清中检出2份鼠疫F1抗体阳性，滴度分别为1 ∶ 80和1 ∶ 160，根据现有动物鼠疫标准提示当地存在动物鼠疫活动的迹象[5]。因此，从2006年开始，在常规鼠疫监测检验的基础上，增加了敏感性高、特异性强的鼠疫菌特异性基因PCR检测方法，进一步的进行疫源检索。经过历时6年对疫源地宿主动物和媒介鼠疫血清学、病原学及分子生物学等动态监测检验，没有实验室数据证明有鼠间鼠疫疫情发生。而且，近年来当地鼠疫宿主动物和媒介种群的密度低，亦未发现与鼠疫菌关系极其密切的传播媒介印鼠客蚤[6]。因此，在近期内义乌市鼠疫历史疫源地尚无鼠间鼠疫活动的迹象。
鼠疫监测检验数据显示，时常有鼠疫F1抗体阳性标本的检出，但没有发现鼠疫病原学阳性标本。 提示我们，一方面在疫源地鼠疫静息期确实很难找到鼠疫感染病原学证据的情况下，利用鼠疫噬菌体的生物学特性，直接进行分离鉴定鼠疫噬菌体，发现有鼠疫噬菌体的地方可以间接证明有鼠疫菌的存在，进一步提高鼠疫疫情的发现能力。另一方面，推测监测中检出的鼠疫F1抗体可能是由非典型鼠疫菌或者是与鼠疫菌有抗原交叉的其他微生物引起的，通过搜索可能存在的非典型鼠疫菌或能表达鼠疫F1抗原的其他菌，分析义乌市鼠中F1抗体的形成原因。

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