湖南省新晃县5岁以下儿童病毒性腹泻的病原监测

疾病监测, 2012, 27(12): 937-943
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2012.12.005

Pathogens causing viral diarrhea in children aged ≤5 years in Xinhuang, Hunan, 2009-2011

YAO Zheng-cai¹, DENG Zhi-hong², YANG Hao², ZHOU Shuai-feng², HU Shi-xiong²

Xinhuang County Center for Disease Control and Prevention, Xinhuang 419200, Hunan, China

Abstract

Objective To understand the epidemiological characteristics of diarrhea and related pathogens in hospitalized children in Xinhuang, Hunan province. Methods Stool samples were collected from the diarrhea children aged ≤5 years in sentinel hospitals in Xinhuang from 2009 to 2011. Rotavirus was detected with immunoreagent kit by DAko and its subtyping/identification was conducted with reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR). Adenovirus was detected with PCR, and astrovirus and calicivirus were detected with RT-PCR. Results From 2009 to 2011, the registered hospitalized patients number was 47 305 in Xinhuang, in which 9714 were children aged ≤5 years and 1506 of them were affected by diarrhea(15.50% of the child patients). Totally 1063 stool samples were detected. The positive rate was 18.38% for rotavirus,4.04% for adenovirus,8.84% for calicivirus and 0.47% for astrovirus. The differences had statistical significance(χ²=251.623,P=0.000). The major subtype of rotavirus A was P[4] in 2009 and 2010, P[8] in 2011, G[3] in 2009 and 2011, and G[1] in 2010. The gender specific difference in detection of rotavirus had statistical significance(χ²=5.657,P=0.017);Except calicivirus, the age specific differences in the positive rates of other 3 viruses had no statistical significance, but the time specific differences in positive rates of rotavirus, adenovirus and calicivirus had statistical significance. Conclusion The major pathogen to cause diarrhea in children aged ≤5 years was rotavirus in Xinhuang, followed by calicivirus and adenovirus. Astrovirus infection was rare.

Keywords: Xinhuang county viral diarrhea surveillance rotavirus

湖南省新晃县5岁以下儿童病毒性腹泻的病原监测

姚正才¹, 邓志红², 杨浩², 周帅峰², 胡世雄²

1. 新晃县疾病预防控制中心, 湖南新晃 419200;
2. 湖南省疾病预防控制中心

摘要

目的了解和掌握湖南省新晃县≤5岁住院腹泻儿童流行特征和病毒性腹泻病原谱构成。方法收集新晃县哨点医院2009-2011年≤5岁住院腹泻患儿的粪便标本,采用Dako公司酶免疫试剂盒检测轮状病毒,采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)进行分型鉴定; 采用PCR检测腺病毒; RT-PCR法检测星状病毒和杯状病毒。结果 2009-2011年新晃县哨点医院共登记住院患者数47 305例,其中≤5岁儿童住院数9714例,≤5岁以下腹泻儿童住院数1506例,占≤5岁住院儿童总数的15.50%;采样检测1063份标本,轮状病毒、腺病毒、杯状病毒和星状病毒的阳性率分别为 18.38%、4.04%、8.84%和0.47%,4种病毒检测阳性率差异有统计学意义(χ²=251.623,P=0.000);A组轮状病毒P分型2009、2010年以P[4]为主,2011年以P[8]为主;G分型2009、2011年以G[3]为主,2010年以G[1]为;不同性别病例检测轮状病毒差异有统计学意义 (χ²=5.657,P=0.017);不同年龄病例标本检测结果除杯状病毒阳性率差异有统计学意义外,其余3种病毒的阳性率差异均无统计学意义;轮状病毒、腺病毒、杯状病毒不同月份的阳性检出率差异有统计学意义。结论轮状病毒是新晃县≤5岁住院腹泻儿童病毒性腹泻的主要病原体,杯状病毒、腺病毒也占有一定的比例,星状病毒感染较少。

关键词: 新晃县病毒性腹泻监测轮状病毒

内容大纲

1 材料与方法

1.1 哨点医院的选择

1.2 住院腹泻监测对象

1.3 标本采集

1.4 信息采集

1.5 检测方法

1.5.1 标本的处理

1.5.2 酶联免疫吸附试验

1.5.3 反转录-聚合酶链反应

1.5.3.1 核酸提取

1.5.3.2 轮状病毒分型

1.5.3.3 人类杯状病毒RT-PCR检测

1.5.3.4 腺病毒PCR检测

1.5.3.5 星状病毒RT-PCR检测

1.6 住院腹泻监测对象

2 结果

2.1 哨点医院≤5岁住院腹泻儿童概况

2.2 时间分布

2.3 病原学监测结果

2.3.2 A组轮状病毒分型

3 讨论

　　病毒性腹泻已经成为许多发展中国家婴幼儿死亡的主要原因之一^[1]，其最常见的病原体主要包括轮状病毒、杯状病毒、肠道腺病毒、星状病毒等。湖南省新晃县位于湖南省西部，东部与湖南芷江县毗邻，南、西、北面与贵州省5个县市相连；全县23个乡镇，26万余人，以侗族为主，共有10多个民族。为了解和掌握新晃县≤5岁住院腹泻儿童流行特征和病毒性腹泻病原谱构成，2009 - 2011年按照卫生部下发的《全国病毒性腹泻监测方案(2007年修订版)》的监测内容和方法，选择新晃县人民医院、兴隆镇卫生院为哨点监测医院，连续3年对两家哨点医院≤5岁的住院腹泻儿童进行监测，每年采集 300～400份住院腹泻儿童粪便标本，按季度送湖南省疾病预防控制中心(CDC)微生物检验科开展病原学检测。现将2009 - 2011年新晃县≤5岁住院腹泻儿童流行病学监测和病原学检测结果进行分析报告，为制定儿童病毒性腹泻防治方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 哨点医院的选择
　　根据既往住院腹泻儿童情况，选择年均≤5岁住院腹泻儿童数在200例及以上的新晃县人民医院、兴隆卫生院为哨点监测医院。
1.2 住院腹泻监测对象
　　住院的腹泻患儿，包括因腹泻住院的患儿以及住院期间有腹泻症状的患儿，住院时间≥24 h，年龄≤5岁，不排除有可能是药物引起、原发疾病的继发腹泻症状的患儿。
1.3 标本采集
　　由哨点医院收集全院所有≤5岁住院腹泻患儿发病3日内的粪便标本，每份5～10 ml；所采集标本置于-20 ℃保存,填写相应的“腹泻标本登记表”和“≤5岁住院腹泻病例个案表”，送湖南省CDC进行轮状病毒、杯状病毒、肠道腺病毒、星状病毒检测。
1.4 信息采集
　　哨点医院负责收集所有住院腹泻监测对象的信息，并填写“住院腹泻病例登记表”，并按月收集本医院相关信息，包括：病床总数，每月≤5岁住院患儿总数和≤5岁腹泻住院患儿总数。
1.5 检测方法
1.5.1 标本的处理
　　制备10%的粪便悬液，将粪便标本加到1.5 ml EP管中，加入标本处理液，振荡3次，每次10 s，然后静置10 min，后以8 r/min离心5 min，吸取上清进行下一步试验或-20 ℃短期保存。
1.5.2 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immonosorbent assay, ELISA)
　　采用ELISA检测A组轮状病毒，具体步骤如下。
①在试剂盒96孔板中每孔加入100 μl粪便悬液离心后的上清，然后与100 μl酶结合物混合，作用1 h，将液体倒掉，并用洗液冲洗4次，再用卫生纸拍打试剂盒板，甩干液体。然后加100 μl显色液，作用10 min，最后加终止液。
②结果判断：如果标本孔中为黄色，则轮状病毒检测阳性，如果是无色，则轮状病毒阴性。
③每次检测样本时分别设置阳性对照和阴性对照。
1.5.3 反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测
1.5.3.1 核酸提取
　　采用Geneaid 病毒核酸提取试剂盒，可用于同时提取病毒脱氧核糖核酸(Deoxyribonucie acid,DNA)和核糖核酸(Ribonucleic acid， RNA)。
在实验开始前，在AD buffer和Wash buffer中分别加入30 ml 和50 ml 96%~100%的乙醇。将200 μl 10％粪便悬液加入EP管中；加400 μl VB Lysis buffer 至已加入粪便悬液的EP管中，vortex 混匀；室温(15～25 ℃)孵育10 min；将VB柱子放入2 ml收集管中；加450 μl已加乙醇的AD buffer至上述样本溶解产物中，vortex 混匀。
小心地打开VB柱盖子，将600 μl溶解混合物移至VB柱子中,注意不要弄湿柱子边缘,盖上盖子，13 000 r/min离心1 min。弃去滤过液，仍将柱子放入原收集管中。小心地打开VB柱盖子，将剩余的样本溶解混合物移至VB柱子中，盖上盖子，13 000 r/min离心 1 min。弃去包含有滤过液的收集管，将VB柱子放入另一新的收集管中。小心地打开VB柱盖子，加400 μl W1 buffer 至VB柱子中，盖上盖子，13 000 r/min离心30 s。弃去滤过液，仍将柱子放入原收集管中。小心地打开VB柱盖子，加600 μl已加过乙醇的 Wash buffer 至VB柱子中，盖上盖子，13 000 r/min离心30 s。弃去收集管中滤过液。13 000 r/min，离心空柱子3 min。将干燥的VB柱放入干净的1.5 ml EP管中。弃去包含有滤过液的收集管。小心地打开VB柱盖子，加50 μl无水 RNase至VB柱中进行洗脱，盖上盖子，室温孵育3 min，13 000 r/min离心1 min。病毒DNA进行PCR，或贮存于-20 ℃或-70 ℃备用。
1.5.3.2 轮状病毒分型
　　轮状病毒阳性的标本进一步进行基因分型，毒株分型采用RT-PCR方法进行。
G血清型分型：一次扩增采用编码VP7基因的保守序列设计引物(正链引物9Con1，负链引物9Con2)，扩增基因的片段，二次扩增正链引物为基因保守序列的公用引物(9Con1)，负链引物根据基因内不同血清型的特征序列设计一组分型引物(9T1、9T2、9T3、9T4、9T9B)，这样从扩增产物的特征分子质量大小即可区别轮状病毒的不同血清型。
P基因型分型：其引物设计原理类似，一次扩增引物(4Con3、4Con4)选择VP4基因内的保守序列，二次扩增负链引物选择不同基因型的特征序列，设计一组分型引物(1T1、2T1、3T1、4T1、5T1)，正链引物仍采用公用引物(4Con3)。试验所需引物序列和设计扩增产物大小见表1。G、P分型的具体实验操作步骤如下：
核酸变性:G分型时，在0.2 ml的EP管中加入正链引物20 μmol/L 9Con1和负链引物20 μmol/L 9Con2各1 μl、RNA模板5 μl、DEPC处理过的水3 μl混合后放在98 ℃超级微量恒温器中变性5 min后，立即放入冰中。P分型时加入的引物则是20 μmol/L 4Con3和20 μmol/L 4Con2，其他加入的试剂均和G分型一致。
反转录及第一次PCR扩增：
(1)在上述0.2 ml EP管中加入下列物质：dH₂O 19 μl，2 mmol/L dNTPs 8 μl，10×buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl₂ 8 μl，成骨髓细胞白血病病毒(Avian myelobastosis virus, AMV)反转录酶10 U/μl 0.2 μl，Taq DNA聚合酶5 U/μl 0.5 μl。
(2)放入PCR仪，条件： 42 ℃ 60 min，98 ℃ 3 min，94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 10次循环;72 ℃ 7 min。
(3)第二次扩增: G分型：dH₂O 28.5 μl, 2 mmol/L 三磷酸脱氧核糖核酸(deoxy-ribondeoside triphasphate,dNTPs) 8 μl, 10×buffer 5 μl; 25 mmol/L MgCl₂ 4 μl, 20 μmol/L 9 Conl 1 μl, 9T1、9T2、9T3、9T4、9T913混合引物各1 μl, 5 U/μl Taq DNA聚合酶0.5 μl; P分型：dH₂O 28.5 μl, 2 mmol/L dNTPs 8 μl, 10×buffer 5 μl, 25 mmol/L MgCl₂ 4 μl, 20 μmol/L 4 Con 3 1 μl, 1T1、2T1、3T1、4T1、5T1混合引物各1 μl, 5 U/μl Taq DNA聚合酶0.5 μl。
在0.2 ml EP管中加入上述反应液，再加入第一次PCR产物2 μl，放入PCR仪中，进行第二次扩增，条件,94 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min, 30次循环；72 ℃ 7 min。
核酸凝胶电泳：将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察和照像，然后与DNA Marker对照，根据目的条带的大小对照表1判断毒株型别。

表1 用于轮状病毒分型的寡聚核苷酸引物
Table 1 Oligonucleotide primer used in rotavirus subtyping

引物	分型用途	位置	序列(5′~3′)	产物大小(bp)
9Con1	G(＋)	37~56	TAG CTC CTT TTA ATG TAT GG
9Con2	G(－)	922~941	GTA TAA AAA TAC TTG CCA CCA	905
9T1	G1(－)	176~195	TCT TGT CAA AGC AAA TAA TG	159
9T2	G2(－)	262~281	GTT AGA AAT GAT TGT CCA CT	245
9T3	G3(－)	484~503	GTC CAG TTG CAG TGT TAG C	467
9T4	G4(－)	423~440	GGG TCG ATG GAA AAT TCT	404
9T9B	G9(－)	131~147	TAT AAA GTC CAT TGC AC	111
4Con2	P(－)	868~887	ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC
4Con3	P(＋)	11~32	TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A	877
1T1	P[8](－)	339~356	TCT ACT TGG ATA ACG TGC	346
2T1	P[4](－)	474~494	CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC	484
3T1	P[6](－)	259~278	TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA	268
4T1	P[9](－)	385~402	TGA GAC ATG CAA TTG GAC	392
5T1	P[10](－)	575~594	ATC ATA GTT AGT AGT CGG	584

9T1、9T2、9T3、9T4、9T9B混合引物，以及1T1、2T1、3T1、4T1、5T1混合引物中，每条单一的引物浓度均为20 μmol/L。上述分型过程中使用的AMV反转录酶购自美国Promega公司，Taq DNA聚合酶购自上海Promega公司。
1.5.3.3 人类杯状病毒RT-PCR检测
　　试验所需引物序列见表2，具体实验操作步骤如下：
①反转录(RT):于0.2 ml PCR管中配制以下RT反应液： 10×buffer 2.5 μl,1%牛血清白蛋白(BSA) 2.5 μl， 2.5 mmol/L dNTPs 5.0 μl, 25 mmol/L MgCl₂ 4.0 μl, 混合289H,I引物(0.2 μg/μl)1.0 μl, 40 U/μl RNasin 0.1 μl, 10 U/μl AMV-RT 0.35 μl, dH₂O 8.05 μl, 模板RNA 1.5 μl, 每管25 μl，42 ℃ 1 h。
②PCR：在0.2 ml PCR管配制以下PCR反应液，并加入以上cDNA 8 μl，共50 μl： 10×buffer 5.0 μl, 25 mmol/L MgCl₂ 4.0 μl, 10 mmol/L dNTPs 1.0 μl, 混合289H,I引物(0.2 μg/μl)1.0 μl, 混合290H、I、J、K引物(0.1 μg/μl)1.0 μl, 5 U/μl Taq DNA聚合酶 0.4 μl, ddH₂O 29.6 μl,
PCR循环步骤如下： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 80 s， 72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。
核酸凝胶电泳：将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察和照像，然后与DNA Marker对照，根据目的条带的大小判断是否阳性，诺如病毒条带大小为319 bp，札如病毒条带大小为331 bp，但两者大小无法用肉眼区分。

表2 用于人杯状病毒检测的引物序列
Table 2 Primer sequence used in detection of human calicivirus

引物	位置	极性	序列(5′~3′)
289H	4865~4886	-	TGA CGA TTT CAT CAT CAC CAT A
289I	4865~4886	-	TGA CGA TTT CAT CAT CCC CGT A
290H	4568~4590	+	GAT TAC TCC AGG TGG GAC TCC AC
290I	4568~4590	+	GAT TAC TCC AGG TGG GAC TCA AC
290J	4568~4590	+	GAT TAC TCC AGG TGG GAT TCA AC
290K	4568~4590	+	GAT TAC TCC AGG TGG GAT TCC AC

混合289H、I引物每一条单一的引物浓度均为0.2 μg/μl, 混合290H、I、J、K引物中每条单一的引物浓度均为0.1 μg/μl。在PCR过程中，使用10 mmol/L dNTPs的量为1 μl，如使用2.5 mmol/L dNTPs，则用量为4 μl，加入的ddH₂O也随之调整。上述过程中使用的AMV反转录酶购自美国Promega公司，Taq DNA聚合酶购自上海Promega公司，RNasin 为RNA酶抑制剂，购自TaKaRa公司，BSA为自行配制。
1.5.3.4 腺病毒PCR检测
　　试验所需引物序列和设计扩增产物大小见表3，具体实验操作步骤如下：
①变性：于0.2 ml PCR管中加入dH₂O 5.0 μl和DNA 3.0 μl，并进行变性：98 ℃ 5 min，立即放入冰中，至少5 min。
② 腺病毒PCR扩增(25 μl) ：取新的0.2 ml PCR管，依次加入下列液体， 10×Taq DNA buffer 2.5 μl， 2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，25 mmol/L MgCl₂ 2 μl， 5 U/μl Taq DNA聚合酶0.125 μl， 33 μmol/L Ad1 0.2 μl，33 μmol/L Ad2 0.2 μl，dH₂ O 15.475 μl， DNA模板2.5 μl。
轻微离心，放入PCR仪中扩增，反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min。
③核酸凝胶电泳：将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察和照像，然后与DNA Marker对照，根据目的条带的大小对照表3判断是否阳性。

表3 腺病毒PCR引物 (根据Hexon gene 设计引物)
Table 3 Primer used in PCR of adenovirus (according to Hexon gene)

引物	位置	序列 (5′~3′)	PCR产物长度(bp)
Ad1	1834~1853	5′-TTC CCC ATG GCI CAY AAC AC-3′	482
Ad2	2315~2296	5′-CCC TGG TAK CCR ATR TTG TA-3′	482

上述过程中使用的Taq DNA聚合酶购自上海Promega公司。
1.5.3.5 星状病毒RT-PCR检测
　　试验所需引物序列和设计扩增产物大小见表4，具体实验操作步骤如下：
①反转录RT(15 μl)：加入下列液体， 5×first strand buffer 2.05 μl， 0.1 mol/L DTT 0.75 μl， 10 mmol/L dNTPs 0.75 μl， 40 U/μl RNasin 0.5 μl， 0.5 μg/μl Random Primer 0.75 μl， 200 U/μl SSIII RT 0.5 μl， DEPC-dH₂O 2.2 μl， RNA 7.5 μl。
42 ℃ 反转录1 h,99 ℃灭活反转录酶5 min，迅速放入冰内。
②星状病毒cDNA PCR扩增(25 μl), 取新的0.2 ml PCR管，依次加入下列液体， 10×Taq DNA buffer 2.5 μl, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μl, 25 mmol/L MgCl₂ 2 μl, 5 U/μl Taq DNA聚合酶0.125 μl, 33 μmol/L PreCap1 0.2 μl, 33 μmol/L 82b 0.2 μl, dH₂O 15.475 μl, cDNA模板2.5 μl。
轻微离心，放入PCR仪中扩增，反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 7 min。
③ 核酸凝胶电泳：将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察和照像，然后与DNA Marker对照，根据目的条带的大小对照表4判断是否阳性。

表4 星状病毒种特异性RT-PCR引物(根据Hexon gene 设计引物)
Table 4 Primer used in RT-PCR of astrovirus virulence specificity (according to Hexon gene)

引物	位置⁽¹⁾	极性	序列 (5′～3′)	PCR产物长度(bp)
PreCap1	4235～4255	+	GGA CTG CAA AGC AGC TTC GTG	719
82b	4953～4934	-	GT GAG CCA CCA GCC ATC CCT	719

注：(1)位于人星状病毒血清1型毒株oxford(GenBank accession no. L23513)的衣壳区。

1.6 统计学分析
　　对资料进行描述性流行病学分析，采用SPSS 17.0软件进行χ²检验，检验水准α=0.05(双侧)。

2 监测结果

2.1 哨点医院≤5岁住院腹泻儿童概况
　　 2009 - 2011年新晃县人民医院、兴隆卫生院共登记住院患者数47 305例，其中≤5岁儿童住院数9714例，≤5岁腹泻儿童住院数1506例，占≤5岁住院儿童总数的15.50%，4月腹泻儿童占住院儿童数的比例最低，为9.74%，11月最高，为24.32%，1、9-12月腹泻儿童所占比例均在17%以上。
2.2 监测住院腹泻儿童人群特征
2.2.1 年龄分布
　　2009 - 2011年对新晃县人民医院、兴隆卫生院采集的1063份≤5岁腹泻儿童标本开展了个案调查。1063例腹泻儿童中，男性564例，女性499例，男女性别比为1.13 ∶ 1；0岁组350例，占病例的32.92%，1岁组252例，占病例的23.71%，2岁组207例，占病例的19.47%，3岁组171例，占病例的16.08%，4岁组74例，占病例的6.96%，5岁组9例，占病例的0.84%。
2.2.2 时间分布
　　1063例病例中,7月监测病例数最多,占17.03%,其次为10、11月，12月未开展监测，1月监测病例数也很少，仅占1.69%，见表5。
2.3 病原学监测结果
2.3.1 4种病毒检测阳性率
　　2009 - 2011年共采集粪便标本1063份，轮状病毒阳性196份，阳性率为18.44%；杯状病毒阳性94份，阳性率8.84%；腺病毒阳性43份，阳性率4.05%；星状病毒阳性5份，阳性率为0.47%；4种病毒检测阳性率差异有统计学意义(χ²=251.623，P=0.000)。不同年份的轮

表5 2009 - 2011年新晃县≤5岁腹泻儿童分月统计
Table 5 Monthly distribution of diarrhea cases in children age ≤5 in Xinhuang,2009 - 2011

月份	2009年	2010年	2011年	合计	构成比(%)
1	14	4	0	18	1.69
2	15	51	0	66	6.21
3	34	11	6	51	4.80
4	20	7	39	66	6.21
5	18	17	28	63	5.93
6	31	49	29	109	10.25
7	70	34	77	181	17.03
8	39	45	35	119	11.19
9	15	26	59	100	9.41
10	39	64	39	142	13.36
11	46	14	88	148	13.92
12	0	0	0	0	0.00
合计	341	322	400	1063	100.00

状病毒、杯状病毒检测阳性率差异有统计学意义，而腺病毒、星状病毒阳性率差异则无统计学意义，见表6。

表6 2009 - 2011年新晃县0~5岁住院腹泻儿童4种病毒检测结果
Table 6 Detection result of 4 viruses in diarrhea children aged 0-5 years in Xinhuang,2009 - 2011

年份	标本数	轮状病毒		腺病毒		杯状病毒		星状病毒
年份	标本数	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)
2009	341	83	24.34	14	4.11	19	5.57	0	0.00
2010	322	63	19.56	17	5.28	39	12.11	2	0.62
2011	400	50	12.50	12	3.00	36	9.00	3	0.75
合计	1063	196	18.38	43	4.04	94	8.84	5	0.47

2.3.2 A组轮状病毒分型
　　1063份粪便标本，196份为A组轮状病毒阳性，进一步进行基因分型(G/P)，P分型检测结果显示，2009、2010年以P[4]为主，2011年则以P[8]为主；G分型2009、2011年以G[3]为主，2010年则以G[1]为主，见表7。
2.3.3 不同性别病例标本检测情况
　　1063例患者

表7 2009 - 2011年新晃县A组轮状病毒分型检测结果
Table 7 Result of rotavirus A subtyping in Xinhuang,2009 - 2011

年份	2009年		2010年		2011年		合计
年份	数量	构成比(%)	数量	构成比(%)	数量	构成比(%)	数量	构成比(%)
阳性数	83	100.00	63	100.00	50	100	196	100.00
P型
P4	6	7.23	22	34.92	11	22	39	19.90
P6	5	6.02	0	0.00	0	0	5	2.55
P8	1	1.20	0	0.00	17	34	18	9.18
P9	1	1.20	0	0.00	0	0	1	0.51
P10	0	0.00	5	7.94	0	0	5	2.55
P(-)	2	2.41	13	20.63	17	34	32	16.33
P(+)	0	0.00	0	0.00	5	10	5	2.55
混合感染	0	0.00	9	14.29	0	0	9	4.59
未分型	68	81.93	14	22.22	0	0	82	41.84
G型
G1	6	7.23	17	26.98	16	32	39	19.90
G2	9	10.84	1	1.59	0	0	10	5.10
G3	20	24.10	2	3.17	17	34	39	19.90
G4	7	8.43	0	0.00	4	8	11	5.61
G8	4	4.82	0	0.00	1	2	5	2.55
G9	8	9.64	0	0.00	0	0	8	4.08
G(-)	1	1.20	8	12.70	12	24	21	10.71
混合感染	0	0.00	17	26.98	0	0	17	8.67
未分型	28	33.73	18	28.57	0	0	46	23.47

中，其中男性564例，女性为499例。男性病例标本的轮状病毒检测阳性率为21.09%，女性检测阳性率为15.43%，二者差异有统计学意义(χ²=5.657，P=0.017)，杯状病毒、腺病毒、星状病毒的男女检测阳性率差异均无统计学意义，见表8。
2.3.4 不同年龄病例标本检测情况
　　轮状病毒和腺病毒均以5岁组检测阳性率最高，分别为22.22%和11.11%，杯状病毒和星状病毒以0岁组阳性率最高，分别为12.57%和0.86%，比较不同年龄检出阳性率，除杯状病毒阳性率差异有统计学意义外(χ²=13.493，P=0.019)，其他3种病毒的阳性率差异均无统计学意义，见表9。
2.3.5 不同月份病例标本检测情况
　　轮状病毒、腺病毒、杯状病毒不同月份的阳性检出率差异有统计学意义(轮状病毒χ²=37.776，P=0.000，腺病毒χ²=38.860，P=0.000，杯状病毒χ²=33.479，P=0.000)，轮状病毒的阳性检出率在1月最高，腺病毒的阳性检出率在10-12月较高，杯状病毒的阳性检出率在9月最高；星状病毒的各月阳性检出率差异则无统计学意义(χ²=10.661，P=0.472)，见表10。

表8 2009 - 2011年新晃县0~5岁不同性别病例标本4种病毒检测结果
Table 8 Gender specific detection result of 4 viruses in diarrhea children aged 0-5 years in Xinhuang,2009 - 2011

性别	标本	轮状病毒		腺病毒		杯状病毒		星状病毒
性别	标本	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)
男	564	119	21.09	24	4.25	47	8.33	2	0.35
女	499	77	15.43	19	3.81	47	9.41	3	0.60
合计	1063	196	18.38	43	4.05	94	8.84	5	0.47

表9 2009 - 2011年新晃县不同年龄病例标本4种病毒检测结果
Table 9 Age specific detection result of 4 viruses in diarrhea patients in Xinhuang,2009 - 2011

年龄组(岁)	标本	轮状病毒		腺病毒		杯状病毒		星状病毒
年龄组(岁)	标本	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)
0~	350	68	19.42	21	6.00	44	12.57	3	0.86
1~	252	55	21.82	8	3.17	24	9.52	1	0.39
2~	207	38	18.35	7	3.38	15	7.25	1	0.48
3~	171	19	11.11	4	2.34	8	4.67	0	0.00
4~	74	14	18.90	2	2.70	3	4.05	0	0.00
5~	9	2	22.22	1	11.11	0	0.00	0	0.00
合计	1063	196	18.44	43	4.05	94	8.84	5	0.47

表10 2009 - 2011年新晃县不同月份标本4种病毒检测结果
Table 10 Monthly detection result of 4 viruses in Xinhuang,2009 - 2011

月份	标本	轮状病毒		腺病毒		杯状病毒		星状病毒
月份	标本	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)	阳性数	阳性率(%)
1	18	6	33.33	0	0.00	0	0.00	0	0.00
2	66	18	27.27	2	3.03	6	9.09	0	0.00
3	50	11	22.00	1	2.00	3	6.00	0	0.00
4	66	18	27.27	0	0.00	5	7.57	0	0.00
5	64	9	14.06	1	1.56	3	4.68	0	0.00
6	108	23	20.29	4	3.70	2	1.85	2	1.85
7	180	11	6.11	0	0.00	12	6.67	0	0.00
8	123	24	19.51	5	4.06	16	13.00	0	0.00
9	100	13	13.00	3	3.00	21	21.00	90	0.00
10	138	26	18.84	12	8.69	15	10.86	2	1.45
11	135	36	26.67	15	11.11	10	7.40	1	0.74
12	15	2	13.33	0	13.33	1	6.67	0	0.00
合计	1063	196	18.44	43	4.05	94	8.84	5	0.47

3 讨论

　　细菌性感染性腹泻的高发季节是夏秋季，而病毒性感染性腹泻则多发生于秋冬季。新晃县人民医院、兴隆卫生院2009 - 2011年监测结果显示，≤5岁腹泻儿童住院数占≤5岁住院儿童总数的15.50%，其中4月腹泻儿童占住院儿童数的比例最低，为9.74%，11月最高，为24.32%，1、9-12月腹泻儿童所占比例均较高，以上监测数据表明病毒性腹泻可导致住院儿童增多，增加疾病负担。
湖南省新晃县2009 - 2011年监测的1063例≤5岁腹泻儿童中，0~、1~、2~、3~、4~和5~岁组分别占病例的32.92%、23.71%、19.47%、16.08%、6.96%和0.84%，住院儿童数随年龄增长而减少，提示病毒性腹泻对低年龄儿童的危害可能更为严重。
新晃县≤5岁住院腹泻儿童的轮状病毒检测阳性率最高(18.38%)，其次是杯状病毒(8.84%)，腺病毒检测阳性率居第3位(4.04%)，星状病毒检测阳性率较低(0.47%)，4种肠道病毒的检测阳性率水平高低序位与其他地区如广州市、北京市等一致，轮状病毒是儿童病毒性腹泻的最主要病原体，杯状病毒亦占有一定的比例。横向比较，新晃县轮状病毒的检测阳性率低于上海市、兰州市及河北省等地区监测结果^[4]；杯状病毒检测阳性率低于济南市(29.25%)和广州市(12.35%)的报道^[5]，与国外文献报道的3.5%～10.0%相近^[6]；腺病毒检测阳性率接近2005 - 2008年兰州市的检出率(4.8%)，低于深圳市(10.8%)^[7]；星状病毒检测阳性率显著低于中国部分地区报告的阳性率(8.7%～16.6%)^[8]。纵向比较，新晃县轮状病毒的检测阳性率在2009年最高，2010年和2011年逐年降低，杯状病毒和腺病毒的检测阳性率在2010年最高，星状病毒则在2011年检测阳性率最高。不同地区、不同年份的检测阳性率差异不仅受人群中真实感染率的影响，采样病例的筛选、采样病例的时间分布等都可能影响到检测阳性率，如采集对象偏向于重症腹泻病例或秋冬季节采样数量偏多，则可能导致检测阳性率偏高。新晃县轮状病毒的检测阳性率在1月最高，腺病毒的检测阳性率在10-12月较高，杯状病毒的检测阳性率在9月最高。因此，应在秋冬季节重点加强儿童病毒性腹泻的防控，应在秋冬季节前给低年龄儿童予以轮状病毒疫苗接种，减少儿童感染轮状病毒引起严重病毒性腹泻的机会。
A组轮状病毒分为G和P两种型别，至今发现27个P型和19个G型，G1、G2、G3、G4、G9、G12和P[4]、P[8]为主要的流行基因型。我国20世纪90年代以G1型为主，2001年以来，G3型取代G1型成为中国优势流行株，P基因型多为P[8]、P[4]型。新晃县P分型检测结果显示，2009年和2010年以P[4]为主，2011年则以P[8]为主；G分型2009年和2011年以G[3]为主，2010年则以G[1]为主。同一地区不同年份轮状病毒血清型不同，不同国家、地区同一年份的血清型也可不同^[9]。监测和了解A组轮状病毒的G、P分型，对于轮状病毒疫苗的研制具有重要的意义，轮状病毒疫苗的组分应包括当地流行的轮状病毒的主要型别。

参考文献

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