少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)为革兰阴性杆菌，属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas spp.)，即以前的少动假单胞菌(Pseudomonas paucimobilis)和CDC Ⅱk-1群^[1]。鞘氨醇单胞菌属目前包括16个种，但只有少动鞘氨醇单胞菌在临床上有重要意义，也是该属的模式种，广泛分布在自然界和医院环境中， 可以从痰液、血液、尿液、伤口和胆汁中分离出来， 也可以从呼吸器、超声雾化器、自来水等分离出，偶可引起术后慢性蜂窝组织炎、败血症等^[1]。近10年来，由少动鞘氨醇单胞菌引起的院内感染时有报道 ，而且该菌种对抗生素的耐药率较高，需要引起临床医师的特别关注。
国内、外文献报道表明，少动鞘氨醇单胞菌医院感染菌株对抗菌药物耐药率较高，但氨基糖苷类药物抗菌活性尚可， 耐药率较低^[6]。是临床推荐治疗少动鞘氨醇单胞菌感染的重要可选择药物。
中国人民解放军第二五一医院在2011年11-12月间先后从同一名脑外伤患者脑脊液中3次分离到少动鞘氨醇单胞菌，这3株少动鞘氨醇单胞菌对氨基糖苷类阿米卡星、庆大霉素均不敏感。为提高对该菌株的认识和临床有效治疗，报道该患者的治疗经过并对从该患者分离得到的菌株对氨基糖苷类药物的耐药机制进行了研究，以期能引起广大临床医生注意。
患者胡某，女，18岁，因“外伤后意识丧失5 h”于2011年9月26日入院。既往体健，无特殊病史。入院后CT检查示：右颞顶急性硬膜外血肿、脑挫裂伤伴开放性颅脑损伤、中颅底骨骨折及颅盖骨骨折。急诊行右颞顶硬膜外血肿清除、去骨瓣减压术。手术顺利，术后给予头孢曲松1 g/d共3 d预防感染。由于患者病情危重，头部皮肤挫裂伤严重，伤口缝合处愈合不良，有少量脑脊液外渗，于2011年10月11日行腰大池置管引流术。操作顺利，引流管通畅，患者无异常反应。2011年11月11日，患者体温明显升高，引流脑脊液可见少量絮状沉淀物，细菌培养示少动鞘氨醇单胞菌，怀疑颅内感染，给予头孢曲松2 g/d抗感染治疗5 d。患者体温稍有下降，引流脑脊液未再出现絮状物。2011年11月22日，引流脑脊液细菌培养再次分离到少动鞘氨醇单胞菌，给予头孢哌酮/舒巴坦1.5 g/d抗感染治疗5 d。2011年12月5日，从患者引流脑脊液中第3次分离到少动鞘氨醇单胞菌，头孢哌酮/舒巴坦联合甲氧苄啶/磺胺甲噁唑治疗颅内感染，抗感染治疗3 d后患者体温明显下降，脑脊液清亮，细菌培养持续阴性。4 d后停止抗感染治疗。于2011年12月15日好转出院。 1.1 细菌生理生化鉴定及药物敏感性测定
　　三次脑脊液培养均使用生物梅里埃公司产品(BacT/ALERTPF培养瓶)，以无菌术抽取患者脑脊液5 ml 注入专用细菌培养瓶中，放入BacT/ALERT血液培养仪内培养。阳性报警后取培养液转种于血平板给予需氧、二氧化碳，35 ℃培养。菌落涂片经革兰染色为革兰阴性杆菌，氧化酶弱阳性，取菌落制备成麦氏0.5的菌液，经BD公司Phoenix 100细菌鉴定仪生理生化鉴定细菌。药物敏感性测定采用最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)法，用Microscan 公司肉汤稀释法药敏板测定细菌药敏结果，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
1.2 细菌总DNA提取及聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增
　　挑取单菌落再划线纯化，分离纯的菌株。用Qiagen公司细胞 DNA提取试剂盒依据试剂盒说明书提取少动鞘氨醇单胞菌总DNA，作为普通PCR扩增耐药基因的模板。
PCR 反应体系及程序：10×buffer 2.0 μl， Primer 1(10 μmol/L) 1.0 μl， Primer 2(10 μmol/L) 1.0 μl， dNTP MiX(2.5 mmol/L each) 2.0 μl， 模板DNA(100 ng/μl) 1.0 μl， Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl) 1.0 μl， ddH₂O 12.0 μl。PCR反应参数为： 预变性：95 ℃， 5 min；变性：95 ℃， 30 s；退火：55~58 ℃，30 s；延伸：72 ℃，45 s~1 min；进行35个循环，72 ℃再延伸10 min。4 ℃保温。PCR反应结束后，取3 μl PCR 产物用0.5×TBE于1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
1.3 氨基糖苷类抗生素耐药基因筛查
　　所筛查的氨基糖苷类耐药基因包括常见的氨基糖苷类抗生素腺苷化酶基因，乙酰化酶基因以及16S rRNA 甲基化酶基因，引物设计及退火温度，产物大小如表1 所示。PCR 反应试剂为Promega公司Greenmix产品。每次扩增均设立不加模板的阴性对照。armA基因扩增时阳性对照菌株为Acinetobacter baumannii MDR-ZJO6，aac(6′)-Ib 基因阳性对照菌株为实验室保存菌株Acinetobacter lwoffii 19。其他基因缺乏阳性对照菌株。

表1 常见氨基糖苷类耐药基因PCR扩增引物及目标片段长度
Table 1 Primer sequences and products length for PCR amplification of aminoglycosides resistance genes

耐药基因	Primers 5′ ~ 3′	长度(bp)	Tm(℃)
ant(2″)-Ia	f: GCT CAC GCA ACT GGT CCA GA	719	58
	r: GGC ACG CAA GAC CTC AAC CT
ant(3″)-Ia	f: TCC AAG CAG CAA GCG CGT TA	887	58
	r: CCG ACT ACC TTG GTG ATC TC
aac(6)-Ib	f: CAT GAC CTT GCG ATG CTC TA	490	58
	r: GCT CGA ATG CCT GGC GTC TT
aac(3)-I	f: TTA CGC AGC AGC AAC GAT GT	420	58
	r: GTT GGC CTC ATG CTT GAG GA
aac(6)-Ⅱ	f: TTC ATG TCC GCG AGC ACC CC	178	55
	r: GAC TCT TCC GCC ATC GCT CT
rmtA	f: CTA GCG TCC ATC CTT TCC TC	635	55
	r:TTG CTT CCA TGC CCT TGC C
rmtB	f: GCT TTC TGC GGG CGA TGT AA	173	55
	r: ATG CAA TGC CGC GCT CGT AT
rmtC	f: CGA AGA AGT AAC AGC CAA AG	711	55
	r: ATC CCA ACA TCT CTC CCA CT
rmtD	f: CCG CAC GCG ATT GGG AAG C	401	55
	r: CGG AAA CAG TGC GAC GAT
armA	f: ATT CTG CCT ATC CTA ATT GG	315	55
	r: ACC TAT ACT TTA TCG TCG TC

2.1 细菌生理生化及16S rDNA鉴定
　　经BD公司Phoenix100细菌鉴定仪鉴定，3次在不同时间分离的菌株鉴定结果均为少动鞘氨醇单胞菌，鉴定可信度为99%。其生化反应如下： 葡萄糖氧化、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、多黏菌素B、植物尿蓝母均阳性， 尿素、柠檬酸盐、丙二酸盐、苯丙氨酸、乳糖、棉子糖、山梨醇、硫化氢、鼠李糖、β-半乳糖苷酶、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。
2.2 细菌药物敏感性鉴定
　　Microscan 药敏板对3次在不同时间分离的菌株对不同药物的MIC值测定结果见表2。

表2 3株少动鞘氨醇单胞菌药物敏感性测定结果
Table 2 Drug susceptibility test result of three S. paucimobilis isolates

抗菌药物	菌株MIC( μg/ml)
	WA1(2011.11.11)	WA2(2011.11.22)	WA3(2011.12.5)
阿米卡星	>32	>32	>32
庆大霉素	>8	>8	>8
亚胺培南	4	4	4
美洛配南	8	8	8
头孢唑啉	>16	>16	>16
头孢他啶	>16	>16	>16
头孢噻肟	>32	>32	>32
头孢吡肟	16	16	16
氨曲南	>16	4	>16
氨苄西林	16	>16	>16
哌拉西林	32	32	32
阿莫西林/棒酸	16/8	16/8	16/8
氨苄西林/舒巴坦	16/8	16/8	16/8
哌拉西林/他唑巴坦	≤4/4	≤4/4	16/4
复方新诺明	1/19	≤0.5/9.5	2/38
氯霉素	8	16	16
环丙沙星	1	1	2
左氧氟沙星	≤1	≤1	2
四环素	4	4	8

2.3 氨基糖苷类耐药基因筛查结果
　　试验结果表明，3株氨基糖苷类耐药少动鞘氨醇假单胞菌基因组中未能扩增出以上在其他病原菌中常见的氨基糖苷类耐药基因(包括氨基糖苷类修饰酶基因和16S rRNA甲基化酶基因)，其耐氨基糖苷类抗生素的机制有待进一步深入研究。 　　根据国、内外菌株药敏结果报道，少动鞘氨醇单胞菌医院感染菌株对抗菌药物耐药率较高，少动鞘氨醇单胞菌对氨曲南的耐药率高达 90%以上， 对大部分的头孢菌素三、四代抗菌药物耐药率约30%，加酶抑制剂的复合药物氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦的抗菌活性也无明显增强。头孢替坦、复方新诺明、环丙沙星耐药也高达48% ~55%， 氨基糖苷类药物抗菌活性尚可， 耐药率较低^[6]，是临床推荐治疗少动鞘氨醇单胞菌感染的重要可选择药物之一。
鞘氨醇单胞菌属药敏试验结果参照CLSI M100-S20 中非肠杆菌科细菌MIC解释标准。本病例中，头孢类药物单独使用治疗效果不佳。需要根据药敏结果联合使用其他种类抗生素。
我们基于以往研究经验，在此次分离的3株少动鞘氨醇单胞菌中扩增在其他病原菌中经常检出的常见的耐药基因，未获阳性结果，提示该菌对氨基糖苷类抗生素的耐药可能由其他基因介导，推测可能是获得了某些外源性的氨基糖苷类抗生素耐药基因，同时也不能排除有非特异的耐药机制参与，如细菌外膜外排泵对药物的外排作用所介导的敏感性下降。需要继续深入的研究以进一步探讨该菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机制。
氨基糖苷类药物是少数能有效对抗少动鞘氨醇单胞菌的有效药物之一，本文中从同一患者分离得到的3株少动鞘氨醇单胞菌对阿米卡星、庆大霉素均不敏感，尽管耐药机制尚未阐明，但仍需引起临床重视。临床感染病例中不乏由耐药菌引起，而抗生素治疗仍然有效的实例，原因可能在于宿主免疫机制的参与。而条件致病菌的感染多见于免疫力低下的患者，耐药的条件致病菌引起的感染在缺乏宿主免疫机制参与的条件下，后果往往更为严重。
抗菌药物是临床医生治疗感染的宝贵资源，与此同时细菌不断进化以获得新的耐药特征。细菌的进化总是与临床感染治疗策略相适应。

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