疾病监测, 2013, 28(2): 115-117
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.2.009
Value of tuberculous infection of T cells spot test in adult pulmonary tuberculosis diagnosis
QI Ming-hao, SHEN Ling, YE Jian, CHEN Hao
No.1 Peoples' Hospital of Hangzhou, Nanjing Medical University, Hangzhou 310006, Zhejiang, China
Abstract
Objective To evaluate the value of an interferon-gamma release assay-tuberculous infection of T cells spot test (T-SPOT.TB) in adult pulmonary tuberculosis (TB) diagnosis. Methods T-SPOT.TB was conducted in 74 suspected pulmonary TB cases by using their peripheral blood in our hospital from March to December 2011. The T-SPOT.TB results were compared with the final diagnoses as well as the results of PPD test. Results The sensitivity and specificity of T-SPOT.TB test were 93.5% and 92.1% respectively. The positive rate of T-SPOT.TB test was significantly higher than that of PPD test (45.2%) in adult pulmonary TB diagnosis (P<0.05). Conclusion T-SPOT.TB has higher sensitivity and specificity than other traditional methods such as PPD test and could be widely used in hospitals.
Keywords:    Tuberculous infection of T cells spot test   tuberculin test   adult pulmonary tuberculosis   diagnosis  

γ干扰素释放分析T-SPOT.TB在成年人肺结核诊断中的临床价值
祁明浩, 沈凌, 叶健, 陈灏
南京医科大学附属杭州市第一人民医院, 浙江 杭州 310006
摘要
目的 探讨γ干扰素释放分析结核感染T细胞斑点试验(Tuberculous infection of T cells spot test,T-SPOT.TB)在成年人肺结核诊断中的意义。 方法 对2011年3－12月在南京医科大学附属杭州市第一人民医院住院治疗的74例成年人疑似肺结核患者进行外周血T-SPOT.TB 检测,其结果与最终诊断相比较,并与结核菌素试验(芒图试验, PPD)进行对比。 结果 T-SPOT.TB灵敏度为93.5%, 特异度为92.1%。在确诊结核病组中,T-SPOT.TB 阳性率显著高于PPD试验(45.2%),差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 T-SPOT.TB检测对成年人肺结核诊断有高度的敏感性和特异性,值得临床推广。
关键词:    结核感染T细胞斑点试验   结核菌素试验   成年人肺结核   诊断  

内容大纲
1 对象与方法
1.1 对象
1.2 方法
1.3 统计学分析
2 结果
2.1 T-SPOT.TB与其他传统结核诊断试验的比较
2.2 T-SPOT.TB诊断肺结核方法学评价
3 讨论
　　结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人类健康的呼吸道传染病。随着人口的大规模流动、结核病与艾滋病同时流行及耐多药结核菌菌株的出现，全球范围内结核病疫情急剧恶化。我国结核病疫情也十分严重，根据世界卫生组织的统计，我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍以上[1]，因此提高结核感染的诊断率尤其重要。早期快速诊断与治疗是控制结核病的关键。目前临床应用于结核病诊断的金标准只有结核菌培养，但结核菌细菌学检查缺乏敏感性，由于条件限制结核菌培养在许多基层医疗机构难以开展，对菌阴肺结核、无痰患者、儿童结核及肺外结核实验室诊断仍比较困难。肺结核临床表现复杂多变， 极易误诊漏诊。传统的临床诊断结核的实验室方法有限。因而，发展能用于诊断结核的快速敏感的实验室技术十分重要。
酶联免疫斑点(enzyme linked inmunospot assay， ELISPOT)技术是一种新型的免疫酶技术， 从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞。由ELISPOT 发展而来的结核感染T细胞斑点试验(Tuberculous infection of T cells spot test，T-SPOT.TB)技术， 使用结核分枝杆菌特异性抗原刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMC)， 通过细胞因子γ干扰素(IFN-γ)的分泌检测抗原特异性T淋巴细胞的应答反应， 从而判断结核感染状态，具有较高的敏感性和特异性 。本文就T-SPOT.TB检测对成年人肺结核病的诊断价值进行初步探讨。
1 对象与方法
1.1 对象
　　对2011年3-12月在南京医科大学附属杭州市第一人民医院住院治疗74例疑似病例或待排除肺结核患者在其他详细检查基础上同时行外周血T-SPOT.TB 检测。收集资料较为齐全的患者共69例，年龄20～78岁，平均43岁；男33例，女36例，病程3 d至5个月。根据以下标准， 将患者分为:(1)肺结核组：包括肯定肺结核病: 结核杆菌培养阳性(金标准) 或痰检抗酸杆菌阳性；很可能肺结核病: 结核杆菌检查阴性或无痰， 但临床表现、影像学或病理组织学检查支持肺结核， 且抗结核药物治疗有效；(2)非肺结核组: 临床表现及辅助检查后明确系其他疾病所致， 或者经其他治疗(未经抗结核治疗)病情改善。74例患者中剔除不完全符合上述条件者5例。总计69例患者且出院后随访至少3个月仍支持出院诊断者进入本研究。
1.2 方法
　　采集患者临床病史、既往结核病史及结核病接触史资料；进行胸片或胸部CT检查、结核菌素试验(芒图试验，PPD)、血沉检测、痰结核菌等检查。
T-SPOT.TB: 采用上海复星科技有限公司提供的试剂盒。基本步骤如下: 取枸橼酸钠抗凝静脉血6 ml，分离PBMC放在包被IFN-γ抗体的微孔板， 加入结核特异性抗原早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和培养滤过蛋白(CFP-10)作为刺激原， 温箱培养24 h后， 洗去抗原致敏效应T淋巴细胞， 加入生物素标记的二抗， 再经酶联显色， 在细胞因子分泌的地方形成斑点， 通过记录斑点数检测结核特异抗原致敏的效应T淋巴细胞数量。结果判断: 当空白对照孔内斑点数<6时， 任一实验孔斑点数减去空白孔斑点数≥6， 结果即为阳性；若空白对照孔斑点数>6， 任一实验孔斑点数大于空白孔斑点数的2倍， 结果也表示阳性。PPD取受试者左或右前臂掌侧下1/3 处皮内注入PPD稀释液0.1 ml，72 h 后检查注射部位的反应，测量浸润硬结横径及垂直径的平均值，浸润硬结平均直径<5 mm为阴性，≥5 mm 为阳性，10～19 mm为中度阳性，≥20 mm强阳性，<20 mm如有水泡、坏死、双圈判断为强阳性。
1.3 统计学分析
　　采用SPSS 11.0 统计软件进行数据分析。各组数据均以阳性率表示，阳性率比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 T-SPOT.TB与其他传统结核诊断试验的比较
　　临床诊断结果最终诊断肺结核31例，排除肺结核38例。分别为继发性肺结核19例、原发性肺结核1例、血型播散性肺结核2例、结核性胸膜炎9例。非肺结核38例。本研究69例患者均做 T-SPOT.TB、PPD，检查阳性率见表1。T-SPOT.TB 检测在肺结核组的阳性检出率显著优于其他传统检查方法， 差异有统计学意义(P<20.05)。

表1 T-SPOT.TB检测与其他结核诊断试验的比较
Table 1 Comparison of results between T-SPOT.TB and other
组别 例数 T-SPOT.TB检测阳性 PPD检测阳性
例数 阳性率(%) 例数 阳性率(%)
例数阳性率
(%)
肺结核组 312993.51445.2
非肺结核组3837.91128.9


2.2 T-SPOT.TB诊断肺结核方法学评价
　　 31例肺结核患者中29例T-SPOT.TB检测阳性， 敏感性为93.5%；PPD检测， 14例为阳性， 敏感性为45.2%。在确诊肺结核病例组中T-SPOT.TB 与PPD比较差异有统计学意义(P<0.05)。38例非肺结核患者中35例T-SPOT.TB 检测阴性， 特异性为92.1%；27例PPD检测阴性， 特异性为71.1%；在特异性上T-SPOT.TB 与PPD比较差异有统计学意义(P<0.05)。T-SPOT.TB检测在敏感性、特异性上均显著优于临床常用的PPD及ESR检查。
3 讨论
　　近年来结核病疫情呈明显上升趋势， 全球所有传染性疾病中， 结核病已成为成年人的首位死因。对于感染结核的患者进行早期诊断和治疗是改善患者预后的关键， 也是控制结核播散的重要环节。结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)是临床常用的筛查结核的免疫学方法， 是长期以来用以快速诊断结核感染的传统方法。然而TST存在诸多缺陷: 在易受结核感染的免疫力低下人群中，其敏感性反而大大降低；结核菌素纯蛋白衍生物(purified prote in derivatives，PPD)是200多种蛋白的混合物，其中很多是非结核分枝杆菌及卡介苗(Bacillus Calmette-Gurin，BCG)的共同抗原成分， 在普遍接种BCG的地区造成非常高的“假阳性率”[4]。此外， 皮试的操作和结果的解释存在主观依赖性， 降低了检查的准确性，因操作简单、快速， 在临床上广为应用， 并常作为启动经验性抗结核治疗的依据， 但有较高的假阳性和假阴性。在本研究中，敏感性最低的为PPD。PPD是诊断肺结核的传统方法， 阳性者表示受试者已感染过结核杆菌，并不一定有发病，我国城市居民的结核感染率在60%以上，如PPD 结果是一般阳性，其诊断意义不大，如表现为强阳性则有一定的临床价值。细菌学检查是诊断结核的金标准， 但常规培养需要2个月的时间， 而且阳性率取决于采集标本中细菌的数量， 不利于早期诊断与治疗。
机体对结核菌的免疫反应主要是由T淋巴细胞发动的细胞免疫。机体被MTB感染后体内T淋巴细胞被致敏，当这些致敏T细胞再次受到结核菌特异性抗原刺激后，就会产生细胞因子IFN-γ。γ干扰素释放试验(Interferon Gamma Release Assays， IGRAs)IGRA技术的原理即首次感染结核杆菌后产生的记忆T淋巴细胞将在人体内长期存在，当再次受到结核杆菌相关抗原刺激后，这些记忆T淋巴细胞迅速增殖成为效应T淋巴细胞。这些效应T淋巴细胞分泌IFN-γ和其他一些细胞因子来刺激T淋巴细胞增殖并可以激活巨噬细胞。由于这个过程是针对特异结核分枝杆菌免疫原(ESAT-6和CFP-10)得到反应，因此通过测定T细胞 IFN-γ释放反应来检查患者是否受到结核分枝杆菌感染。IGRAs的结果通过检测代表结核分枝杆菌的抗原反应后释放IFN-γ的量来判断。由于IGRAs技术使用的抗原是结核分枝杆菌RD1和RD16区编码的蛋白， 这些蛋白在卡介苗中缺失， 所以IGRAs 能够较好地区别BCG接种和结核分枝杆菌感染， 从而使得IGRAs用于检测结核感染[5]。本研究对疑诊或待排结核性肺病患者在进行其他详细检查基础上同时进行T-SPOT.TB 检测。结果表明，T-SPOT.TB检测诊断结核性肺病敏感性为93.5%， 特异性为92.1%， 与文献报道相似。且敏感性、特异性上均显著优于临床常用的PPD检查，差异有统计学意义(P<0.05)。由于结核菌特异性抗原(ESAT-6和CFP-10)的应用， 排除了BCG接种及大多数非结核分枝杆菌的影响，特异性提高，并且整个试验操作相对简单、快速，24~48 h即能得出结果，能够早期提供灵敏、 特异的结核感染证据， 帮助临床医师 做出正确的病因学判断。因此对于不易获得痰标本的肺结核及痰涂片阴性的肺结核病例的诊断具有重要价值。IFN-γ释放试验目前已经列入美国、欧洲等地结核病诊疗指南， 以协助诊断结核感染的存在。但我国结核病感染率高达44.5%，约5亿人感染结核分枝杆菌，T-SPOT主要局限性在于不能区分“结核分枝杆菌感染”和“活动性结核病”。由于T-SPOT检查价格较为昂贵，故在本试验设计中未设置健康对照组(即健康人)，未设置健康对照组是T-SPOT诊断特异性高达93.5%的部分原因。事实上，由于我国结核病高感染率的现状，T-SPOT阳性患者特别是弱阳性患者，仍需结合临床及其他实验室检查仔细甄别。
综上所述， T-SPOT.TB 较其他传统方法在诊断结核感染方面具有良好的敏感性和特异性， 已被越来越多的国家认可并应用于临床诊断。 尽管目前费用较高， 但对临床症状不典型、诊断不明确、病情凶险、易引发纠纷的患者同时进行T-SPOT.TB检测， 其结果可为患者的早期诊断、及时制订治疗方案提供帮助。现有结核诊断方法存在诸多缺陷， T-SPOT.TB可以为临床医师提供参考， 指导临床实践，值得临床推广。

参考文献
[1] Technical direction group of national tuberculosis epidemiological survey. National sampling survey of tuberculosis epidemiology,2000 [J]. Chinese Journal of Antituberculosis,2002,24(2):65-66. (in Chinese) 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组. 2000年全国结核病流行病学抽样调查报告[J]. 中国防痨杂志,2002,24(2):65-66.
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[3] Lalvani A, Pareek M. Interferon gamma release assays: principles and practice[J]. Enferm Infecc Microbiol Clin,2010,28(4):245-252.
[4] Lee E, Holzman RS. Evolution and current use of the tuberculin test[J]. Clin Infect Dis,2002,34(3):365-370.
[5] Mahairas GG, Sabo PJ, Hickey MJ, et al. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis[J]. J Bacteriol,1996,178(5):1274-1282.