疾病监测, 2013, 28(2): 132-135
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.2.014
Establishment of real time RT-PCR assay for detecting novel Bunyavirus L gene
YU Ji-yan1, WANG Zhong-fa2, REN Yi1, MAO Bin1
Daishan County Center for Disease Control and Prevention, Zhoushan 316200, Zhejiang, China
Abstract
Objective To develop a sensitive and specific real time reverse transcription PCR (RT-PCR) assay for nucleic acid detection of novel Bunyavirus. Methods Primers and TaqMan probe were designed according to the L gene of novel Bunyavirus and the real time RT-PCR was used to detect novel Bunyavirus from serum and plasma samples of 50 clinical suspected patients and from serum of 25 healthy people. Two virus strains isolated from the patients’ serum were used to evaluate the specificity and sensitivity as well as the reproducibility of the established real time RT-PCR assay. Results The established real time RT-PCR assay had high specificity, with the Ct values showing good linear relation to the copy numbers of template DNA in the standard curve (R2=0.999). In this assay, the target gene could be detected if the template DNA is more than 25 copies in 25 μl PCR reaction, indicating that the sensitive detection limit was 1 copy/μl. The reproducibility tests indicated that the intraassay coefficient of variation were all lower than 1.0%. Among the 50 patients’ serum samples, 30 were positive, 25 control’s serum samples and 28 rats lung and testes samples were all negative. Two of 8 blood samples were positive in virus culture. Conclusion The established real time RT-PCR assay was with high specificity, sensitivity and reproducibility, which could be used in the rapid nucleic acid detection of novel Bunyavirus in humans and animals and applied in the preliminary identification of the virus after isolation and culture.
Keywords:    real-time RT-PCR   novel Buyavirus   nucleic acid detection  

TaqMan探针实时荧光定量反转录-聚合酶链反应检测新布尼亚病毒L基因方法的建立与应用
虞吉寅1, 王忠发2, 任宜1, 毛彬1
1. 岱山县疾病预防控制中心, 浙江 舟山 316200;
2. 舟山市疾病预防控制中心
摘要
目的 建立敏感、特异、实时荧光定量反转录-聚合酶链反应 (real time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, rRT-PCR)方法,用于新布尼亚病毒的核酸检测。 方法 以新布尼亚病毒L基因为靶基因设计引物以及TaqMan 探针,建立real-time RT-PCR方法,并对舟山市岱山县50份临床疑似患者血清、血浆、25份正常人群血清和从患者血清中分离到的2株病毒样本进行了检测鉴定,并验证了方法的特异性、敏感性和重复性。 结果 建立的real-time RT-PCR具有良好的特异性,标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(R2=0.999),最低检出浓度为1拷贝/μl,重复性评估批内变异系数均<1.0%。在103份检测标本中,50份临床病例血清血浆标本,30份为阳性,健康人群血清25份和28份鼠肺、鼠肾均为阴性,8份病毒分离培养血样中2份为阳性。 结论 本研究建立的real-time RT-PCR方法具有较高的特异性、敏感性和重复性,可用于人与动物新布尼亚病毒核酸的快速检测、病毒分离培养的初步鉴定等。
关键词:    real-time RT-PCR   新布尼亚病毒   核酸检测  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.2 核酸提取
1.3 探针、引物的设计与重组质粒(标准品)的构建
1.4 新型布尼亚病毒real-time RT-PCR扩增体系优化结果
1.5 反应灵敏度评估
1.6 反应特异性评估
1.7 反应的重复性评估
1.8 扩增效率(E)值计算与标准曲线制备
1.9 阳性结果判断
2 结果
2.1 real-time RT-PCR反应体系和反应条件的确立
2.2 利用质粒外标准品进行敏感性评估
2.3 方法重复性评估
2.4 方法特异性评估
3 讨论
　　新布尼亚病毒是发热伴血小板减少综合征(SFTS)的重要病原体，主要通过蜱叮咬传播 。临床表现主要为急性起病、发热、乏力、恶心、呕吐等胃肠消化道症状以及多器官功能损害，血小板、白细胞减少及肝肾功能异常等，严重者可导致死亡。该病临床症状与人粒细胞无形体病(human granulocytic anaplasmosis，HGA)病相似，容易发生误诊[3]，因此建立快速、准确的诊断方法十分重要。新型布尼亚病毒的检测和诊断技术主要有两大类：基于病毒抗原、抗体反应的免疫学方法和针对病毒RNA的核酸检测技术。 近年来，实时荧光定量反转录-聚合酶链反应 (real time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction， real time RT-PCR)方法以其高特异性、高敏感性、重现性好且检测快速等的优点广泛应用于病原微生物的早期诊断[3]。本研究以新布尼亚病毒依赖RNA的RNA聚合酶基因组(L)为靶基因设计引物以及TaqMan 探针[4]，建立了real-time RT-PCR检测新布尼亚病毒的方法，并利用该方法对舟山市岱山县临床疑似患者血液、野鼠内脏、分离病毒等标本进行了新布尼亚病毒核酸快速检测，为舟山市岱山县SFTS的临床诊治与疾病控制提供了实验室依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
　　 real-time RT-PCR反应体系采用大连宝生物工程有限公司(TaKaRa) One Step PrimeScript RT-PCR Kit(DRR064A、DRR055A)配制，反应仪器采用美国ABI公司的7500实时荧光PCR仪与Bio-Rad公司的My cycle普通PCR仪。对照试剂来自于中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所提供的用于临床样本诊断的巢式RT-PCR引物序列[1]和中山大学达安基因公司的新型布尼亚病毒检测试剂盒(批号20120329)。Vero-E6与Vero细胞分别由浙江省CDC、宁波市CDC提供。
1.2 核酸提取
　　75份血液样本为25例临床疑似病例的血清和血浆，25份对照样本为健康人群血清，28份监测样本为鼠肺、鼠肾，2株患者血清中分离到的新布尼亚病毒[1]。甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒、 肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)、汉坦病毒等阳性样本均为日常监测中获取标本。上述样本的RNA提取采用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit试剂盒(货号74104)，按说明书提取病毒核酸。
1.3 探针、引物的设计与重组质粒(标准品)的构建
　　根据已经公布的新型布尼亚病毒核酸序列的特点，选取其L片段基因中保守性较高的片段作为靶序列。从GenBank下载AB 678796.1序列，选取358～445 bp之间的序列作为靶序列，该段序列长度为88 bp，GC含量为50.0％，经BLAST特异性分析，与已知人DNA序列和与发热相关的其他RNA病毒序列无明显的相似性，说明该片段的特异性也很好，因此将其作为检测新型布尼亚病毒核酸的靶序列。依照待检靶分子序列，设计一条序列中间位置395～420区间片段与负链互补的荧光标记探针，由26个核苷酸组成，其5′端以FAM标记，3′端连接淬灭分子TAMRA。上游引物：L358 5′-AGC AGC CTG AGT AAA GGG CAT GTA-3′，下游引物：L445 5′-TTG AGC TAA AGC GAA AGC AGT GGC-3′，TaqMan探针：P395 5′-(FAM)TGG CAG CAG GAG TAT ACC TTC TCT CA(TAMRA)-3′。将靶序列(88 bp)进行基因合成，将合成的靶基因片段与T载体连接，导入JM109感受态细胞，构建重组质粒，并经测序确认该合成序列准确无误，构建的重组质粒作为标准cDNA模板。引物、探针合成以及靶基质粒构建及鉴定均由宝生物工程有限公司完成。
1.4 新型布尼亚病毒real-time RT-PCR扩增体系优化结果
　　2×One step RT-PCR BufferⅢ 12.5 μl；Ex Taq、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ、ROX Reference Dye、10 μmol/L 上游引物、10 μmol/L下游引物、5 μmol/L TaqMan探针各0.5 μl；DEPC水4.5 μl；模板5.0 μl；反应总体积25 μl。扩增条件：反转录42 ℃ 5 min；预变性95 ℃ 10 s；变性95 ℃ 5 s、退火延伸60 ℃ 31 s, 共45个循环，在60 ℃FAM通道收集荧光信号。
1.5 反应灵敏度评估
　　将标准品重组质粒从5×106拷贝/μl为起始浓度做10倍梯度稀释至5×00拷贝/μl等7个不同浓度，对上述不同稀释度分别进行real-time RT-PCR反应，以确定该方法能检测出的最低核酸量。
1.6 反应特异性评估
　　甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒、EV71、Cox A16、汉坦病毒的RNA与新布尼亚病毒的RNA同时进行RT-PCR反应，观察是否有非特异性的扩增曲线以确定该方法的特异性。
1.7 反应的重复性评估
　　以5个梯度浓度的重组质粒标准品为模板，每个稀释度作3次重复测试，计算每个稀释度Ct值的标准偏差(s)和变异系数(CV)，对计算结果统进行统计学分析。
1.8 扩增效率(E)值计算与标准曲线制备
　　E=10 -1，理想值0.8
1.9 阳性结果判断
　　real-time RT-PCR检测以Ct值<40并且扩增曲线形态良好(呈“S”形)为阳性判定原则。其中Ct值<36且扩增曲线良好可直接判定为阳性，Ct值在36～-40之间需重复检测，若Ct值仍在40以内可判定为弱阳性，Ct值在40～-45且扩增曲线呈“S”形的样本建议用更敏感的巢式RT-PCR做进一步检测并结合流行病学、临床症状及血清特异性抗体IgM检测结果进行最终判断。无扩增曲线的样本为阴性。
2 结果
2.1 real-time RT-PCR反应体系和反应条件的确立
　　总反应体系为25 μl，上、下游引物的终浓度为 0.2 μmol/L，探针的终浓度为0.1 μmol/L，2×RT-PC缓冲液12.5 μl，Taq DNA聚合酶、反转录酶、ROX各0.5 μl，DEPC水4.5 μl，RNA模板5 μl。参考引物探针的退火温度，确定反应条件为42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s；45个循环，60 ℃ FAM通道采集荧光信号，优化后的试剂盒与中山大学达安基因公司的新型布尼亚病毒检测试剂盒平行检测，检测结果的Ct值、扩增曲线形态基本一致。
2.2 利用质粒外标准品进行敏感性评估
　　将构建的质粒载体外标准品稀释成不同浓度，用荧光定量RT-PCR进行检测，结果样本中新型布尼亚病毒依赖RNA的RNA聚合酶基因片段(外标准品)检出的敏感性达到5.0×100拷贝/μl。以外标准品浓度为5.0×106～5.0×100拷贝/μl时，对应的Ct值显示为37.28。按每个PCR反应的标准品DNA模板加量为5 μl换算，每个反应管中的拷贝数为25个，即每个PCR反应管中只要有25个拷贝的目的基因即可被检测到，最低检出浓度为1拷贝/μl，见图1。


图1 Real-time RT-PCR的检测敏感性与相对应的扩增曲线形态
Figure 1 Real time RT-PCR detection sensitivity and relevant amplification curve
Real-time RT-PCR的检测敏感性与相对应的扩增曲线形态
注：1~7分别为5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103、5.0×102、5.0×101、5.0×100拷贝/μl。

2.3 方法重复性评估
　　对10倍系列稀释的5个浓度的外标准品进行荧光real-time RT-PCR测试，每个浓度做3次重复试验，5个浓度重复样品的CV 为0.05％～0.51％之间，可见该方法具有较好的重复性，结果见表1、图2。由该5个标准品浓度对数值及其对应Ct值绘制的标准曲线的R2＝0.999，由直线斜率(-3.1976)计算出的扩增效率(E)为1.05，可见所得的荧光曲线与所检测的外标准品浓度之间具有较好的相关性。结果见表1、图3。
2.4 方法特异性评估
　　分别检测了人H1N1、甲3型、甲1型、乙型流感病毒、Cox A16、EV71型及汉坦病毒的RNA模板，结果显示新布尼亚病毒样品检测到很强的荧光信号， 其余非新布尼亚病毒样品检测

表1 Real-time RT-PCR检测新布尼亚病毒标准品的重复性实验结果
Table 1 Repeatability of real-time RT-PCR in detection of novel Bunyavirus standard samples
标准品浓度
(拷贝数/μl)		Ct值(x ±s)CV(%)
10618.78±0.010.05
10522.12±0.010.05
10425.35±0.130.51
10328.61±0.060.21
10231.52±0.020.06



图2 质粒外标准品浓度对数值及其对应Ct值绘制的标准曲线
Figure 2 Plasmid standard concentration on Ct value and its corresponding numerical drawing standard curve
质粒外标准品浓度对数值及其对应<i>Ct</i>值绘制的标准曲线


图3 1份新布尼亚病毒样本与7份其他病毒样本的real-time RT-PCR检测结果
Figure 3 Detection result of novel Bunyavirus and other viruses with real-time RT-PCR
1份新布尼亚病毒样本与7份其他病毒样本的real
结果均未见荧光信号(检测拷贝数为0)，表明本方法具有特异性。利用该方法检测25例临床疑似病例血样，检出阳性15例，血清和血浆的检测结果基本一致，并从上述患者的8份血清中成功地分离到2株新型布尼亚病毒。25例对照人群血清与28份野鼠内脏检测结果均为阴性也未见任何形态的扩增曲线。结果与中国CDC传染病预防控制所提供的巢式RT-PCR以及中山大学达安基因公司的新型布尼亚病毒检测试剂盒检测结果一致。可见本方法在现场疑似病例检测中也具有良好的特异性，结果见图3。其中1份新布尼亚病毒样本有扩增曲线为阳性样本，其他均为阴性。
3 讨论
　　2009-2010年，在河南、湖北、山东、安徽、江苏、辽宁等省出现了发热伴血小板减少综合征病例，经中国CDC研究证实是由一种新型布尼亚病毒感染所致，该病毒被命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒。该病毒为布尼亚病毒科白蛉病毒属中新的一组对人类具有高致病性病毒[5]。2011年5月舟山市发现浙江省首例由新布尼亚病毒感染引起的SFTS病例后逐年增多趋势明显，该病在舟山市的流行高峰为5-6月，疑似病例阳性检出率高达77.78％(14/18)。
本方法选用来源于舟山市的新布尼亚病毒依赖RNA的RNA聚合酶基因序列(AB678796.1)为靶基因设计引物以及TaqMan探针，经实验室内部测试和现场临床病例的检测结果分析显示该方法具有新布尼亚病毒的种属特异性，其检测的灵敏度可达到每个PCR反应管中只要有25个拷贝的目的基因即可被检测到，显示出很高的敏感性。经10倍连续稀释的标准品经3次平行样品检测比较Ct值结果一致，说明该方法具有良好的批内重现性。由标准品浓度对数值及其对应Ct值绘制的标准曲线的R2值为0.999，扩增效率(E)为1.05，可以认为系统误差较小，实验操作准确，结果可信。本方法整个实验操作过程，包括核酸提取在内，检测时间仅为90 min左右，用于SFTS患者检测和病毒分离初步鉴定具有简单快速、特异敏感、重复性好等效果。岱山县为悬水海岛，交通不便，SFTS流行季节也是海上大雾与台风多发季节，经常影响患者血样及时上送。自本方法建立与应用后，SFTS患者的实验室诊断时间缩短为2 h以内，明显提高了临床治疗效果，实现了患者的早诊断、早治疗，受到当地临床和流行病学医生高度评价。
新布尼亚病毒感染引起的SFTS是一种新发传染病，有些规律尚不清楚，笔者发现该病毒在患者血清中有2个特点应引起重视：(1)急性期患者的病毒载量变化缺少规律，建议临床医生在第1份血样检测阴性时，最好隔天后再采1份血样作第二次检测。(2)患者血清中新布尼亚病毒的载量普遍较低，多数患者血清检测Ct值在30以上，因此检测结果Ct值在35～40之间的样本不能轻易判断为阴性，应结合临床症状和流行病学特征进行综合判断。我们曾对8份Ct值在35～40之间，流行病学与临床症状典型的SFTS患者血清样本采用巢式RT-PCR方法做进一步检测均获得明显的阳性条带，上述条带经序列测定、Blast比对结果与浙江省在GenBank上登的HE663216.1和AB678798.1、两株新布尼亚病毒核衣壳蛋白基因序列符合率高达99.4%～99.8％，建议对于Ct值介于35～40之间的样本，最好用巢式RT-PCR核实后再报告结果，避免误诊给临床治疗造成困难以及由此引起的医疗纠纷。

参考文献
[1] Zhang YZ,Zhou DJ,Xiong Y,et al.Hemorrhagic fever caused by a novel tick-borne Bunyavirus in Huaiyangshan,China[J].Chin J Epidemiol,2011,32(3):209-220.
[2] Yu XJ,Liang MF,Zhang SY,et al.Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China[J].N Engl J Med,2011,364(16):1523-1532.
[3] Fu XP,Wang JQ,He JR,et al.Establishment of real-time PCR assay to detect Anaplasma phagocytophilum Msp2 gene with TaqMan MGB probe[J]. Disease Surveillance,2012,27(2):141-144.(in Chinese) 付秀萍,王景泉,贺金荣,等.TaqMan MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测人粒细胞无形体Msp2基因方法的建立[J].疾病监测,2012,27(2):141-144.
[4] Qin XC,Zhou DJ,Chen XP,et al. Viruses of the family Bunyaviridae and their associateddiseases[J]. Chinese Journal of Epidemiology,2010,31(10):1111-1114.(in Chinese) 覃新程,周敦金,陈小萍,等.布尼亚病毒科病毒及相关疾病[J].中华流行病学杂志,2010,31(10):1111-1114.
[5] Lu J, Li C, Zhang FS, et al. Structure and non-structural protein expression of Bunyamwera virus causing thrombocytopenia with fever [J]. Chinese Journal of Virology,2011,27(6):515-520. (in Chinese) 卢静,李川,张福顺,等. 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白的表达研究[J].病毒学报,2011,27(6):515-520.