3.1 概述
　　 快速鉴定手足口病的病原体，特别是有无 肠道病毒71型(EV71)感染，有助于指导临床管理，关注可能出现的并发症。当患者出现EV71感染和其他的临床表现时，如中枢神经系统受累或心血管系统功能衰竭，快速的病毒学诊断甚至更有帮助，因为患者当时的紧急状况能否采用的特异性的治疗手段会带来完全不同的结局。另外，当发生手足口病暴发时，快速的病原学诊断对于预测重症病例的发生，及时采取合适的公共卫生干预措施也十分重要。与其他的肠道病毒一样，传统的确诊方法主要是细胞培养和病毒分离鉴定，但是这两种方法费时费力。现代分子生物学技术已经取得很大发展并在一些实验室中应用。有效且准确的病毒学诊断的还依赖于正确及时收集合格的临床标本，并按规定的条件转运至实验室。这需要实验室技术人员、流行病学专家和临床医生的密切合作。
3.2 实验室安全
　　实验员必须遵守相关的生物安全、化学、水、火等相关的安全规范以确保临床标本和感染材料的安全处理和工作人员、社区和环境的安全。实验室负责人和参与该诊断实验的员工必须熟知国际上和地方的生物安全规定，包括临床标本和感染物的安全处理和运输、良好的微生物学技术，以及所需的符合生物安全的实验设备，通常病毒初步分离要求在生物安全2级实验室进行。
3.3 临床标本
　　不管住院病例还是门诊病例，咽拭子和疱疹液拭子放在病毒运输液保存，是最有价值的标本，可以明显提高病毒的检出率。EV71可以从粪便中排出数周后检出，因此，粪便标本或者肛拭子也是检测病毒和/或分离病毒的合适标本。
当有发生聚集性感染而不是个别感染的风险时，应考虑采集部分临床标本，特别是粪便标本。疱疹液是最有价值的标本，因为疱疹的出现意味着当前的系统性感染。如果从患者那里采集了大量的标本，那么实验室将不堪重负。
为了增加肠道病毒阳性检出率，建议对所有的患者采集咽拭子和至少2份疱疹液标本，没有疱疹的患者可采集肛拭子。脑脊液中EV71和 柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)的阳性检出率非常低，不到5%。但是脑脊液对于检测其他肠道病毒，特别是B组的肠道病毒引起的无菌性脑膜炎的诊断有重要价值。尽管住院患者的血清标本对于血清学诊断非常重要，其他是EV71的血清学诊断的可靠性值得进一步研究。
3.4 实验室诊断方法
　　与其他的肠道病毒一样，包括脊髓灰质炎病毒，细胞培养、病毒分离和鉴定仍然是目前病毒诊断的金标准。由于EV71分离后，仍需要进一步的分子生物学的鉴定，所以病毒分离和鉴定费时、费力，这种方法不能满足临床诊断的实际需要。尽管目前有些方法可以对临床标本进行快速诊断，但仍需对这些方法进行标准化、对其可靠性进行全面的评估。
3.4.1 病毒分离
　　有些临床标本在病毒培养前要进行前处理(充分混匀、过滤、氯仿处理)。多种人类与非人类的灵长类细胞系能用于肠道病毒的分离与鉴定。其中RD(人横纹肌肉瘤细胞)和Vero(非洲绿猴肾细胞)两种细胞系由于灵敏性高并且细胞病变明显(CPE)被广泛用于分离EV71 和Cox A16。RD细胞可通过全球脊髓灰质炎网络实验室获得，为确保其对脊髓灰质炎病毒的敏感性，该细胞系的质控是严格按照脊髓灰质炎实验室手册操作完成的。用于病毒分离的细胞系质量对于标准化进行肠道病毒的分离与鉴定是非常重要的。
同时采用几种不同的人类与灵长类的细胞系来提高病毒分离阳性率非常重要。附加的细胞系(如MRC-5， HEL， HeLa， L20B)也能够用于EV71和其他肠道病毒的分离，包括脊髓灰质炎病毒。尽管EV71和其他肠道病毒A组毒株的特异性受体还有待鉴定，但是小鼠的细胞系由于能够表达功能性的EV71受体(人类P-选择素和糖蛋白配体复合物受体、清道夫B组Ⅱ型受体)对于从临床标本中选择性分离培养EV71和Cox A16有重要的帮助。乳鼠(48 h内)也可用于分离某些A组肠道病毒，特别是疱疹性咽峡炎的临床标本。然而用乳鼠进行病毒分离和鉴定相当耗时，并且需专业的技术人员和设备。
3.4.2 病毒鉴定
3.4.2.1 中和实验
　　当EV71 和Cox A16分离完成后，接下来需要用型特异性血清抗体进行中和实验来进行病毒血清型的鉴定。肠道病毒A组的特异性血清，包括EV71 和Cox A16血清，并没有现成的商品化试剂而是由实验室内部提供，这限制了中和抗体实验的应用。中和实验仍然是目前比较稳定可靠的肠道病毒鉴定方法，但是这个实验需要5～7 d(1周左右)才能完成。
3.4.2.2 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及测序
　　 病毒分离培养后，目前广泛应用RT-PCR，利用各种基因(5′-UTR， VP1，VP4/VP2基因)引物扩增病毒RNA，对去氧核糖核酸(DNA)扩增产物测序方法，对病毒进行分子生物学鉴定。RT-PCR及测序方法的优点是，不管肠道病毒属于哪一种基因型、血清型、甚至于新发现的、变异的基因型与血清型，这两种方法均能广泛检测到。通常对较短的VP4或者VP4加VP2测序已经能够满足常规监测的需要，但是当进行分子生物学研究时，则需要对VP1基因进行测序。这是由于VP1是位于病毒的表面，并且具有抗原决定因子的衣壳蛋白，因此它很可能在免疫压力下发生突变。 RT-PCR和测序法需要依赖诊断实验室的测序仪，并且需要较高的设备安装与运行成本，并且实验室专家和技术人员需要接受专门的培训，以尽可能减少病毒的分子生物学鉴定过程中交叉感染，确保测序、数据处理、分析时结果的可靠性。
3.4.2.3 EV71特异性RT-PCR
　　病毒分离培养后，应用EV71特异引物进行RT-PCR可用于EV71的分子生物学鉴定。应用EV71型特异性引物进行RT-PCR是一种非常简单而快速的诊断方法，并且安装和运行成本较低。但是EV71型特异性引物设计需要根据新发现或者新变异病毒株进行调整，以保证EV71特异性RT-PCR的可靠性。同时也需要对实验室技术人员进行全方位培训，尽可能减少病毒分子鉴定实验过程的交叉污染。
3.4.2.4 间接免疫荧光法
　　用EV71单克隆抗体进行接免疫荧光法(IFA)是一种快速而有效的EV71鉴定方法。IFA方法简单而快速。
3.4.2.5 临床标本直接快速诊断
　　 巢式RT-PCR：目前以保守的5′-UTR作为目的基因进行扩增可用于肠道病毒的通用检测。但是5′-UTR的RT-PCR扩增方法并不适合用于血清分型和EV71的鉴定。随着RT-PCR技术方法的不断改进，目前可采用共有序列简并杂合寡核苷酸引物(CODEHOP)方法对VP1基因的部分序列进行扩增，对所有已知肠道病毒的血清型进行检测，这种方法具有很高的灵敏性和特异性。因此，可以采用CODEHOP法扩增VP1基因，直接对临床标本进行诊断。多重RT-PCR已被用于进行EV71和Cox A16的鉴定，也可用于直接检测临床标本中的EV71和Cox A16。
实时荧光定量PCR：最近实时荧光定量RT-PCR常常用来对多种病毒性传染病的快速和特异性诊断。与传统的RT-PCR方法特别是巢式RT-PCR法相比，单管道的实时RT-PCR法能够减少交叉污染的风险。然而目前报道的几种EV71特异性实时RT-PCR方法的可靠性需用EV71、 Cox A16、 HEV-A的不同基因型和临床标本进行验证。总之，实时荧光定量RT-PCR方法所用的特异性EV71的引物和探针均需要根据EV71新的变异株与新发现病毒株进行调整，以保证检测的可靠性。
新的诊断方法：除了EV71特异性实时定量RT-PCR外， EV71其他的快速而简便(床边检测)的检测方法仍处于研究阶段。虽然有些免疫色谱法抗原试剂盒能够购买到，并用于多种病毒性传染病的检测，但是目前尚无检测EV71抗原的成品试剂盒，可能原因是对EV71临床标本的低敏感性。虽然反转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)是一种快速而灵敏的肠道病毒检测的新方法，但是对于检测肠道病毒的某些血清型(基因型)没有特异性。
3.4.3 新的诊断方法评估
　　为促进地方快速而简便的EV71感染诊断试剂的开发，建立诊断方法的灵敏性与特异性的一套标准化评估体系已经迫在眉睫。为了更好评估这些分子生物学鉴定方法，有必要建立起包括EV71所有的基因亚型(A，B1-B5；C1-C5以及新发现基因型)的毒株库，同时建立质控体系和网络实验室来确保未来的鉴定肠道病毒和亚型程序的标准化。
3.4.3.1 EV71毒株的分子流行病学分析(EV71基因分型)
　　EV71分子生物学鉴定(EV71基因分型)是一种鉴定优势流行株的非常有效方法。通过比较不同EV71株之间基因的变异程度，可以发现病毒的地理分布与进化起源。根据EV71主要的膜蛋白VP1基因库，可以建立一种快速追踪地区间的传播和目前的优势流行株的方法。尽管对VP1基因的部分测序即可满足基因分型的需要，但是如果要对EV71进行详细的分子流行病学分析，则必须对VP1基因全长进行测序分析。
3.4.3.2 血清学实验
　　通常不推荐中和抗体实验来做肠道病毒常规的检测。双份血清检测可以用来鉴定某些特定血清型，但有时对检测抗体滴度的解释比较困难。另一方面，EV71中和抗体实验能够用于评估社区人群EV71感染免疫水平，以及用来监测不同EV71基因型之间的交叉反应。
血清学方法还可以快速检测住院患者的EV71感染的IgM抗体，但是血清学检测EV71感染的特异性和灵敏性仍有待进一步评估。
刘社兰 摘译自 WHO：A Guide to Clinical Management and Public Health Response for Hand,Foot and Mouth Disease(HFMD) 2011：22-25 林君芬 张静审校]