手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒感染引起的常见传染病，主要症状表现为手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹。少数病例可出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，重症及死亡病例多由EV71感染引起，致死原因主要为脑干脑炎及神经源性肺水肿^[1]。HFMD传染性强，易导致流行或暴发^[2]。目前该病已呈全球性流行趋势，我国北京、上海、浙江、安徽、山东、广东和深圳等地均有HFMD的发病报道。2008年5月2日，我国卫生部已将HFMD纳入丙类传染病管理。为了解2011年深圳市手足口病的病原学情况，2011年对该年度临床诊断为手足口病的409例病例粪便标本，进行肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)、柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16， Cox A16)以及其他肠道病毒检测，现将结果报告如下。 1.1 材料
1.1.1 标本来源
　　2011年深圳市手足口病哨点医院临床诊断为HFMD的病例，采集此类患者发病3～5 d内的粪便标本409份，放入-20 ℃冰箱保存备用。
1.1.2 主要试剂
　　Roche High Pure viral RNA Kit；EV71病毒荧光PCR检测试剂盒；Cox A16病毒荧光PCR检测试剂盒；肠道病毒通用型荧光PCR检测试剂盒；TaKaRa one step RNA PCR Kit(AMV)；琼脂糖；GoTaq^ Green Master Mix(Promega M7122)； GoTaq^ Hot Start Green Master Mix(Promega M5122)；SuperScript^TMⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR， PrimeScript^ Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit。
1.2 方法
1.2.1 PCR引物设计
　　本实验中对其他肠道病毒阳性的标本核酸进行cDNA合成及RT-nestedPCR所采用的引物序列均参考GenBank发表的基因组序列，使用Primer Premier 5.0软件进行设计，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，其核苷酸序列和扩增片段长度详见表1。

表1 cDNA合成和RT-snPCR引物序列及产物大小
Table 1 cDNA synthesis and primer sequence and product size of RT-nPCR

引物名称	引物序列	引物名称	引物序列
AN32-VP1	GTY TGC CA	222-VP1	CIC CIG GIG GIA YRW ACA T
AN33-VP1	GAY TGC CA	224-VP3	GCI ATG YTI GGI ACI CAY RT
AN34-VP1	CCR TCR TA	AN88-VP1	TAC TGG ACC ACC TGG NGG NAY RWA CAT b
AN35-VP1	RCT YTG CCA	AN89-VP1	CCA GCA CTG ACA GCA GYN GAR AYN GGb

1.2.2 标本预处理和病毒RNA的提取
　　取绿豆大小的粪便标本，加Hanks液800 μl制成10%～20%的悬液，8000 r/min离心5 min；取200 μl上清液，采用Roche 公司的High Pure viral RNA Kit，严格按照试剂盒说明书进行操作，提取的RNA立即进行反转录或置-80 ℃保存备用。
1.2.3 荧光RT-PCR(Real time RT-PCR)
　　采用深圳太太基因工程有限公司提供的EV71、Cox A16及肠道病毒通用型核酸荧光PCR检测试剂盒，按说明书进行操作。
1.2.4 巢式RT-PCR(RT-nestedPCR)
　　对EV71阴性和Cox A16均为阴性，而肠道病毒通用型核酸阳性的标本核酸进行RT-nestedPCR扩增。
(1) cDNA合成的反应体系：10×RT buffer 1 μl，Mg²⁺(25 mmol/L) 1 μl，DTT(0.1 mol/L) 1 μl，RNaseOUT(40 U/μl)：0.5 μl，Each dNTP(10 mmol/L) 0.5 μl，Each Primers(10 μmmol/L) AN32、AN33、AN34、AN35各0.125 μl，SuperScript Ⅲ RTase(200 U/μl) 0.5 μl，RNA Template 5 μl，共10 μl。反应条件为22 ℃ 10 min， 45 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。10 μl反转录产物全部用于第一步PCR反应。
(2)第一步PCR反应体系：Green Master Mix 25 μl，Primer 224(10 μmol/L) 3.5 μl，Primer222 (10 μmol/L) 3.5 μl，Nuclease-Free Water 8 μl，Template(反转录产物)10 μl，共50 μl。反应条件为 95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，60 ℃，45 s，40个循环；72 ℃ 10 min。
(3)第二步PCR反应体系：Green Master Mix 25 μl，Primer AN89(10 μmol/L) 3.5 μl，Primer AN88(10 μmol/L) 3.5 μl，Template(第一步PCR反应产物)1 μl，Nuclease-Free Water 16 μl，共50 μl。反应条件为：95 ℃ 3 min， 95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 22 s，40个循环；72 ℃ 10 min。
1.2.5 电泳
　　PCR反应结束后，取10 μl第二步PCR产物用1×TAE电泳缓冲液制备1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为100 V，30 min，用凝胶成像分析系统进行观察，阳性标本在紫外灯下可以观察到350～400 bp目的扩增条带。
1.2.6 DNA序列测定和分析
　　阳性标本的第二步PCR产物直接由TaKaRa公司纯化后使用ABI3730XL DNA序列自动测序仪进行序列测定，测序引物为AN89和AN88。所有PCR产物从正反两个方向进行序列测定，互相核实补充。将测序所获得的基因序列在NCBI网站进行Blast分析，以最终确定该病原的型别。 2.1 病原检测结果
　　409 例手足口病临床病例中，324例检出阳性，总阳性率79.22%，其中142 例为EV71阳性，阳性率34.72%，构成比为43.83%；53例为Cox A16阳性，阳性率为12.96%，构成比为16.36%；128例为非EV71、非Cox A16的其他肠道病毒阳性，阳性率为31.54%，构成比为39.81%。
2.2 时间分布
　　2011年深圳市手足口病的发病高峰期集中在5-9月，11月出现一个小高峰。EV71的发病高峰为3-8月，11月出现一个小高峰；Cox A16发病率低于EV71和其他肠道病毒；非EV71、非Cox A16的其他肠道病毒病例数5-12月比较多，见图1。

图1 2011年深圳市手足口病病原型别及阳性病例时间分布
Figure 1 pathogen type and time distribution of HFMD cases in Shenzhen，2011
2.3 年龄分布
　　409例手足口病病例中，5岁以下儿童占93.64%，主要集中在1~岁组儿童，占44.01%，见表2。

表2 2011年深圳市哨点医院手足口病病例年龄分布
Table 2 Age distribution of HFMD cases in sentinel hospitals in Shenzhen，2011

年龄组(岁)	手足口病		EV71阳性数	Cox A16阳性数	其他肠道病毒阳性数
	例数	构成比(%)
0～	56	13.69	22	11	12
1～	180	44.01	52	24	70
2～	74	18.09	32	6	22
3～	49	11.98	18	7	13
4～	24	5.87	10	2	4
≥5	26	6.36	8	3	8
合计	409	100.00	142	53	129

2.4 性别分布
　　409例临床诊断病例中，男性患儿251 例，女性患儿158 例， 男女病例比例为1.59 ∶ 1， EV71、Cox A16和其他肠道病毒阳性率性别差异无统计学意义(EV71:χ²=1.2042<χ²_0.05，1=3.84， P>0.05；Cox A16：χ²=0.0409<χ²_0.05，1=3.84，P>0.05；PE：χ²=0.0014<χ²_0.05，1=3.84，P>0.05)，见表3。

表3 2011年深圳市哨点医院手足口病不同性别、不同病原检测情况
Table 3 Gender specific pathogen detection in sentinel hospitals in Shenzhen，2011

性别	病例数	EV71			Cox A16			其他肠道病毒
		阳性数	阳性率(%)		阳性数	阳性率(%)		阳性数	阳性率(%)
男	251	82	32.67		33	13.15		79	31.48
女	158	60	37.98		20	12.66		50	31.65
合计	409	142	34.72		53	12.96		129	31.54

2.5 核苷酸序列测定及分型结果
　　对129份荧光PCR检测结果为非EV71、非Cox A16的其他肠道病毒阳性标本核酸进行RT-Nested PCR扩增，95例扩增出阳性条带，并对95例阳性PCR产物送大连宝生物公司进行序列测定，将测序结果进行Blast分析，分型结果见表4。

表4 95例非EV71、非Cox A16的其他肠道病毒阳性标本的分型结果
Table 4 Pathogen classification of 95 other enteroviruses infections

病毒名称	例数	构成比(%)
Cox A6	69	72.63
Cox A10	12	12.63
Cox A12	1	1.05
Cox A9	1	1.05
Cox A2	1	1.05
Cox A4	1	1.05
Cox B2	1	1.05
Cox B4	3	3.16
ECHO2	4	4.21
ECHO14	1	1.05
ECHO18	1	1.05
合计	95	100.00

　　手足口病严重危害儿童健康， 引发手足口病的肠道病毒有20多种，EV71、柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及埃可病毒均为手足口病较常见的病原体。我国自1980年开始有HFMD的报道，1985年以前Cox A16是该病的唯一病原，但随后研究结果显示EV71在HFMD的病原学中占有越来越重要的地位。当前对手足口病的研究主要集中于EV71感染与该病的关系，而对Cox A16和其他肠道病毒感染所致手足口病的研究较少。本次研究409 例手足口病临床病例中，324例检出阳性，总阳性率为79.22%，其中142 例为EV71阳性，阳性率34.72%；53例为Cox A16阳性，阳性率为12.96%；129例为非EV71、非Cox A16的其他肠道病毒阳性，阳性率为31.54%；95例非EV71、非Cox A16的其他肠道病毒经测序后，Cox A6 69例，Cox A10 12例，构成比分别为72.63%和12.63%。表明在2011年深圳市哨点医院手足口病病原构成中，Cox A6已经取代Cox A16的位置排在第2位，仅次于EV71，另外Cox A10也占有较大比例，提示今后一定要加强对手足口病肠道病毒的型别鉴定，比较每年的优势病毒型别，对手足口病的有效预防控制及治疗具有指导意义。
一般重症病例与EV71构成比呈正相关关系^[3]，本研究所用标本均来自手足口病一般轻症病例，未有重症病例的标本，故与2010年深圳市监测结果(43.29%)相比较，本次研究EV71阳性率相对较低。
本研究表明2011年深圳市哨点医院手足口病的发病高峰期集中在5-9月，11月出现一个小高峰；EV71的发病高峰为3-8月，11月出现一个小高峰；Cox A16发病率低于EV71和其他肠道病毒；非EV71、非Cox A16的其他肠道病毒发病率在5-12月都比较高，说明除夏秋季节外，也要特别做好冬季手足口病的预防控制。
本研究中EV71、Cox A16和非EV71、非Cox A16的其他肠道病毒的男女阳性率差异无统计学意义，与部分文献报道不一致 ，但与深圳市的研究结果相符^[7]，提示是否手足口病发病率性别差异存在地方性差异，将有待于进一步研究。
有文献报道，儿童出生后会从母体继承一部分肠道病毒抗体，但1个月后会迅速下降，从2～5岁肠道病毒抗体每年提高12%，到5～6岁时血清抗体水平达到一个稳定的状态，所以肠道病毒攻击的目标人群多为5~6岁以下的儿童，其中1~3岁儿童最为常见^[8]。今后要特别加强对3岁以下婴幼儿的手足口病监测工作，及时发现跟踪病例，防止病情进展导致出现重症甚至死亡病例。

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