疾病监测, 2013, 28(3): 193-196
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.3.007
Surveillance of diarrhea case cluster caused by Salmonella Agona
QU Mei1, ZHANG Xin1, WANG Xiao-li1, HUANG Ying1, QIAN Hai-kun1, LIU Gui-rong1, LI Wei2, KAN Biao2, WANG Quan-yi1
Beijing Municipal Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China
Abstract
Objective To find out the possible clustering of sporadic diarrhea cases occurred in same period by using pulse field gel electrophoresis assay and conduct epidemiological survey and tracing. Methods Through PulseNet established in Beijing, the stool samples were collected from diarrhea patients to conduct pathogen isolation, biochemical identification, serotyping, drug susceptibility test and PFGE subtyping. Results From 2 to 7 May 2012,9 strains of Salmonella Agona were isolated from 22 stool samples of intestinal outpatients in a district in Beijing. The 9 strains of S. Agona showed same PFGE pattern by XbaⅠ enzyme digestion. In comparison with PulseNet China central database and local network laboratory database, the pattern was confirmed as a new type, encoded as JABX01.CN0072. Conclusion It suggested that 9 S. Agona isolates might be from same clone considering the highly concentrated infection time and place distribution of the cases and the clustering of PFGE pattern. Although common exposure factors were not found by the subsequent epidemiological survey and analysis of infection source, PFGE subtyping can improve the sensitivity of the surveillance. It is necessary to conduct consecutive molecular typing surveillance of pathogens and further improve PulseNet system and operation mechanism.
Keywords:    pulse field gel electrophoresis   Salmonella Agona   surveillance   PulseNet China  

阿贡纳沙门菌引起的聚集性腹泻病例监测及分析
曲梅1, 张新1, 王小莉1, 黄瑛1, 钱海坤1, 刘桂荣1, 李伟2, 阚飙2, 王全意1
1. 北京市疾病预防控制中心传染病地方病控制所, 北京 100013;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
摘要
目的 应用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分子分型技术分析时间上高度集中的散发腹泻病例,发现可能的聚集性,并进行流行病学调查和追溯。 方法 利用已建立的北京市肠道多病原分子分型监测系统,采集腹泻病例粪便标本进行病原菌分离培养、生化鉴定、血清凝集、药敏试验及PFGE分子分型。 结果 2012年5月2-7日连续一周内,从北京市某区(县)肠道门诊采集的22份腹泻病例粪便标本中分离到9株沙门菌,血清学鉴定为阿贡纳沙门菌。XbaⅠ 酶切的PFGE带型一致,与中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络(PulseNet China)中心数据库及各地区网络实验室数据比对分析后,确认该带型为一新的图谱带型,编码为JABX01.CN0072。 结论 9 例阿贡纳沙门菌感染病例的发病时间和地理分布高度集中,且PFGE带型聚集成簇,提示感染菌株具有同一克隆来源。随后的流行病学调查和感染来源分析,虽并未发现共同暴露因素,但说明PFGE技术的应用可以提高监测的敏感性,应长期持续的进行病原菌分子分型监测,进一步完善PulseNet网络和运行机制。
关键词:    脉冲场凝胶电泳   阿贡纳沙门菌   监测   中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 标本来源及背景
1.2 生化鉴定和血清学诊断
1.3 药敏试验
1.4 PFGE分析
2 结果
2.1 菌落形态及生化鉴定
2.2 血清学鉴定
2.3 药敏试验
2.4 PFGE分子分型及流行病学调查
3 讨论
　　沙门菌是世界上食源性腹泻最常见的病原菌之一，全球每年约有9400 万沙门菌感染病例，其中16万例死亡[1]。北京市自2010年起，对肠道门诊散发腹泻病例开展肠道多病原分子分型监测[2]。在全市7个监测区(县)选择17家哨点医院，每个监测区(县)每周采集10份散发腹泻患者粪便标本进行包括沙门菌在内的多种肠道致病菌检测。对于分检菌株应用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)技术，进行病原菌分子分型实验，以确定散发病例之间的病原学关联性，查找传染源、分析传播链， 通过预警、监测和干预，以达到预防和控制疾病的目的。
2012年5月初连续一周之内，在某区(县)两家肠道门诊就诊的9例腹泻病例的便标本中分离到9株沙门菌，经血清学鉴定为阿贡纳沙门菌。进一步的PFGE分子分型显示所有菌株PFGE带型相同，经 中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络(PulseNet China)中心数据库及各地区网络实验室数据比对分析后确认为一新的带型，编码为 JABX01.CN0072。在短时期内出现同一PFGE带型的阿贡纳沙门菌感染的腹泻病例，引起我们的高度关注，随即开展了流行病学调查和监测，结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源及背景
　　2012年5-6月在北京市7个监测区(县)肠道门诊采集腹泻病例粪便标本进行常规病原学监测。所有待检标本保存在Cary-Blair运送培养基中，4 h 内送至各区(县)疾病预防控制中心(CDC)，同时进行志贺菌、沙门菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌和5种致泻性大肠埃希菌等多种病原体的分离培养、初步生化鉴定和血清分型。分离到的阳性菌株送至北京市CDC进行PFGE分子分型实验。某监测区(县)5月初的前两周共采集22例腹泻患者粪便标本，其中9例检出阿贡纳沙门菌，基本信息见表1。
1.2 生化鉴定和血清学诊断
　　沙门菌的分离鉴定参照中华人民共和国卫生行业标准(WS 271 - 2007 附录B1)。腹泻患者粪便标本用亚硒酸盐亮绿磺胺增菌液增菌后，SS选择性培养基分离培养。挑取平板上单个可疑菌落接种克氏双糖斜面培养基(KIA)，进行初步生化鉴定。在洁净玻片上滴加诊断血清与刮取KIA斜面上的少许菌苔混匀，根据凝集情况判断结果。系统生化鉴定采用法国生物梅里埃VITEK Compact 2全自动微生物鉴定系统。诊断血清采用泰国S&A和丹麦血清。
1.3 药敏试验
　　使用法国生物梅里埃VITEK Compact 2全自动微药敏系统， AST-GN13药敏卡进行鉴定。
1.4 PFGE分析
　　参照PulseNet制定的沙门菌PFGE标准分型方法。沙门菌标准株H9812作为分子质量标记。内切酶 XbaⅠ(40 U)，37 ℃酶切3 h。电泳条件：电压6 V/cm，脉冲时间从2.2～63.8 s，线性转换，转换角度120°，电泳时间19 h，电泳温度14 ℃。脉冲场凝胶电泳仪为Bio-Rad，CHEFⅢ；凝胶成像系统为 Bio-Rad，Gel-DOCXR。内切酶购自New England公司。采用BioNumerics(5.0)软件对电泳图像进行处理、网络化数据传输和比对分析。聚类树状图根据非加权配对算术平均法(unweighted pair-group method using arithmetic averages，UPGMA)构建。
2 结果
2.1  菌落形态及生化鉴定
　　SS平板上经37 ℃、18 h培养后出现无色、细小、半透明菌落。可疑菌落接种KIA进行培养，生化特征为：乳糖-，葡萄糖+，产酸产气，H2S+，动力+。
2.2 血清学鉴定
　　采用玻片凝集法，9株菌的凝集结果一致，即菌体O抗原：O4群+，O12群+；鞭毛抗原：Hf+， Hg+， Hs+；生理盐水对照不凝集，故9株沙门菌判定为阿贡纳沙门菌。
2.3 药敏试验
　　9株沙门菌药敏结果见表2。结果显示，9株菌都对头孢唑林、头孢替坦、丁胺卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素等5种抗生素耐药，对其他13种抗生素敏感。
2.4 PFGE分子分型及流行病学调查
　　北京市既往阿贡纳沙门菌共计35株，经XbaⅠ 酶切，PFGE分子分型结果见图1。从图1可看出本研究报道的9株阿贡纳沙门菌(2012SM031~2012SM039)为同一PFGE带型，与其他阿贡纳分离株不同。将阿贡纳沙门菌PFGE图谱， 经网络上传到PulseNet China中心数据库进行比对分析，没有发现相同带型的菌株，确认为新的带型，编码为JABX01.CN0072。结合流行病学调查资料，9例病例虽然临床症状轻微，无明显的共同特征，但发病时间为2012年5月2-7日，病例的地理分布为同一区(县)，时间和区域都表现为 高度集中，由此推断感染菌株可能系为同一克

表1 9例病例的基本信息
Table 1 Basic information of 9 diarrhea cases
菌株编号性别年龄(岁)发病日期发热(℃)腹痛腹泻(次/日)粪便形状恶心呕吐
2012SM031男622012-05-03<38.0-3稀便 --
2012SM032女392012-05-04<38.0-10稀便 ++
2012SM033女282012-05-0438.2-2稀便 --
2012SM034男312012-05-04<38.0+5鲜血便--
2012SM035男612012-05-02<38.0+10稀便 --
2012SM036男322012-05-05<38.0-2稀便 --
2012SM037女352012-05-06<38.0-6水样便++
2012SM038男422012-05-05<38.0+3稀便 +-
2012SM039男12012-05-07<38.0-4黏液便--


表2 9株沙门菌药敏结果
Table 2 Drug susceptibility of 9 Salmonella isolates
抗生素名称2012SM0312012SM0322012SM0332012SM0342012SM0352012SM0362012SM0372012SM0382012SM039
氨苄西林SSSSSSSSS
氨苄西林/舒巴坦SSSSSSSSS
哌拉西林/他唑巴坦SSSSSSSSS
头孢唑啉RRRRRRRRR
头孢替坦RRRRRRRRR
头孢他啶SSSSSSSSS
头孢曲松SSSSSSSSS
头孢吡肟SSSSSSSSS
单酰胺菌素SSSSSSSSS
厄他培南SSSSSSSSS
亚胺培南SSSSSSSSS
丁胺卡那霉素RRRRRRRRR
庆大霉素RRRRRRRRR
妥布霉素RRRRRRRRR
环丙沙星SSSSSSSSS
左氧氟沙星SSSSSSSSS
呋喃妥因SSSSSSSSS
甲氧苄氨嘧啶SSSSSSSSS


图1 北京市阿贡纳沙门菌PFGE聚类分析图
Figure 1 PFGE dendrogram of S. agona isolates in Beijing
北京市阿贡纳沙门菌PFGE聚类分析图
隆来源。为查明感染来源，在全市发布了预警信息，并对9例病例进行了回溯性调查，9例患者均为散发病例，无共同聚餐史和外出旅行史，也没有发现明显的食源性暴露因素和流行病学关联。在后续的腹泻病例监测及食品污染物应急风险监测中，截止6月底，北京地区没有再出现具有相同PFGE带型阿贡纳沙门菌。
3 讨论
　　沙门菌是引起感染性腹泻和食物中毒最常见的致病菌，其血清型复杂，多达2700余种。北京市近年来腹泻病例监测发现40余种不同的沙门菌血清型，阿贡纳沙门菌是较为常见的血清型，位居前5位，但由于沙门菌血清型呈散在分布，分离到的阿贡纳沙门菌菌株数量有限，从2006 - 2012年仅分离到35株，所占比例为5%～8% 。
2012年5月初在北京市分离到的9株阿贡纳沙门菌，PFGE带型一致，与既往菌株带型不同，且这9例病例发病时间和地区高度集中，由此推断感染菌株可能为同一克隆来源。但流行病学相关调查显示，9例感染者间没有共同聚餐史，也没有发现明显的食源性暴露因素。9株沙门菌药敏谱也完全一致，对头孢类(头孢唑林、头孢替坦为一代、三代头孢)和氨基糖苷类(丁胺卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素)抗生素出现耐药；作为新出现的克隆群，出现5重耐药，这与连续多年的沙门菌耐药性监测结果一致[4]，多重耐药菌株广泛存在，应引起高度重视。在后续的腹泻病例监测及食品污染物应急风险监测中，没有发现持续传播的迹象。据报道，阿贡纳在上海地区的流行也呈高度散发状态，其人间致病力相对肠炎和鼠伤寒沙门菌较弱，而且PFGE型别分散，遗传关系较远[5]。阿贡纳沙门菌的生物学特点表现为人群传播力弱，加之本起事件缺乏详实的流行病学基础资料支持，增加了此次调查的难度和不确定性。
北京市自2010年首批加入中国细菌性传染病分子分型监测网络，成立区域中心实验室以来，积极参与 PulseNet China 病原菌分子分型网络建设[6]。就此次阿贡纳沙门菌感染病例成簇聚集的事件，我们及时向中国CDC报告了信息，网络传输图谱，得到PulseNet China国家中心实验室及广东、山东、浙江、河南、上海、深圳等地网络实验室的支持和积极回应，通过网络化比对分析，没有发现相同带型的菌株。这也说明此次阿贡纳沙门菌事件比较局限，并没有表现为多点传播。
本起事件利用病原菌分子分型技术，及时发现了菌株间的成簇，启动应急调查和主动监测，虽然最终没有找到明确的感染来源，但这种工作模式是以实验室病原菌分子分型比对结果为基础，开展实验室监测和流行病学监测相结合的探索性尝试。此次调查启示：(1)要具备美国PulseNet那样成熟的监测体系和既往本底数据的支持，只有数据容量足够大，查询、比对、分析结果时，才会提供一定的指示和线索，而本次比对的监测数据多为既往人源菌株，食品或外环境来源菌株则较为少见。(2)对与一过性、没有持续存在或隐匿性强的感染暴露因素，溯源难度相对较大，需要及时开展深入细致的流行病学调查，反应速度和时效性是目前制约成功溯源的瓶颈。(3)疾病控制、卫生监管和食品安全等各级、各部门之间的协作和沟通。追踪感染来源、评价风险、消除隐患都需要各方的信息交流、联防联控才能实现。因此，开展长期持续的病原菌分子分型监测，进一步完善PulseNet China网络建设，建立规范的工作机制，将为我们今后在类似事件的处理上提供质量保证。

参考文献
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