疾病监测, 2013, 28(3): 224-229
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.3.016
Detection of drug susceptibility and resistant genes in selected food borne Listeria monocytogens in China
WANG Tian-shu1,2, WANG Yan2, HE Chun-yue1,2, YE Zheng-xing2, WANG Yi1, XU Ke3, YU Hua3, WANG Yong-lu4, ZHANG Lan-rong5, ZENG Ying-chun6, XU Xue-bin7, WANG Hong8, CHEN Wei-wei9, WANG He1, YE Chang-yun2
1. Department of Microbiology, Guiyang Medical University, Guiyang 550004, Guizhou, China;
2. Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract
Objective To understand the drug susceptibility and relationship between antibiotic resistant genes and resistant phenotype in selected food borne Listeria monocytogenes strains in China. Methods The drug susceptibility of 203 food borne Listeria monocytogenes strains was detected by broth micro dilution test as recommended by Clinical and Laboratory Standards Institute. A total of 20 antibiotics, including gentamicin, ampicillin, penicillin, tetracycline, doxycycline, imipenem, erythromycin, ciprofloxacin, levofloxacin, cephalothin, rifampin, vancomycin, chloramphenicol, trimethoprim-sufamethoxazole, ampicillin-sulbactam, norfloxacin, polymyxin B sulfate, nitrofurantoin, clindamycin and cefuroxime, were used in the drug susceptibility test. Polymerase chain reaction(PCR) was conducted to detect 9 resistance genes and transposon Tn916. Results The resistant rates of the food borne Listeria monocytogenes strains to polymyxin B sulfate, nitrofurantoin, cefuroxime, clindamycin, tetracycline, doxycycline, ciprofloxacin, norfloxacin, chloramphenicol were 98.52%,55.66%,50.25%,12.81%,2.46%,1.97%,0.99%,0.99% and 0.49%, respectively. In the 203 food borne Listeria monocytogenes strains, tetM gene was only found in 5 tetracycline-resistant strains,3 of which were positive for Tn916. Conclusion Different levels of antibiotic resistance were detected in the tested food borne Listeria monocytogens, in which 83 strains were multi-drug resistant, demonstrating the risk of causing food borne Listeria monocytogenes infection Therefore, we should enhance the management of antibiotic use, insure food safety and improve public health.
Keywords:    Listeria monocytogenes   broth micro dilution test   Tn916 conjugative transposon  

中国部分食品分离单增李斯特菌的抗菌药物敏感性及耐药基因检测
王天姝1,2, 王艳2, 贺春月1,2, 叶正兴2, 王毅1, 许柯3, 俞骅3, 汪永禄4, 张兰荣5, 曾莹春6, 许学斌7, 王红8, 陈伟伟9, 王和1, 叶长芸2
1. 贵阳医学院微生物学教研室, 贵州 贵阳 550004;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室;
3. 浙江省杭州市疾病预防控制中心;
4. 安徽省马鞍山市疾病预防控制中心;
5. 北京市通州区疾病预防控制中心;
6. 湖北省武汉市疾病预防控制中心;
7. 上海市疾病预防控制中心;
8. 四川省自贡市疾病预防控制中心;
9. 福建省疾病预防控制中心
摘要
目的 了解我国部分食品中分离单增李斯特菌的抗菌药物敏感性和耐药性,探讨单增李斯特菌耐药基因的携带与耐药表型的关系。 方法 采用微量肉汤稀释法对2005-2011年从我国7个省市/地区食品分离的203株单增李斯特菌进行庆大霉素、氨苄西林、头孢噻吩、青霉素、四环素、强力霉素、亚胺培南、红霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、利福平、万古霉素、氯霉素、氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明、诺氟沙星、头孢呋肟、多粘菌素B、呋喃妥因、氯林可霉素共20种抗菌药物药敏试验,采用PCR方法对实验菌株进行9种耐药基因及接合型转座子Tn916检测,并对阳性基因产物进行序列测定分析。 结果 食源性单增李斯特菌对多粘菌素B、呋喃妥因、头孢呋肟、氯林可霉素、四环素、强力霉素、环丙沙星、诺氟沙星和氯霉素的耐药率分别为98.52%、55.66%、50.25%、12.81%、2.46%、1.97%、0.99%、0.99%和0.49%。203株单增李斯特菌中,5株对四环素耐药的菌株均检测出tetM基因,其中3株菌的tetM基因位于接合型转座子Tn916上。 结论 食品中分离的单增李斯特菌存在不同程度的耐药情况,并有83株多重耐药株存在,具有引起食源性单增李斯特菌感染的风险存在,应加强对抗生素使用的管理以保证食品安全及公众健康。
关键词:    单增李斯特菌   微量肉汤稀释法   接合型转座子Tn916  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 菌株
1.2 仪器与试剂
1.3 方法
1.3.1 药物敏感性试验
1.3.1.1 菌株活化
1.3.1.2 菌液制备
1.3.1.3 菌液接种
1.3.1.4 孵育
1.3.1.5 观察结果
1.3.2 耐药基因的检测
2 结果
2.1 单增李斯特菌的药敏试验结果
2.2 同年份单增李斯特菌的耐药情况
2.3 不同地区单增李斯特菌的耐药情况
2.4 耐药基因及转座子Tn916的检测结果
3 讨论
　　单增李斯特菌(Listeria monocytogene， LM)是一种细胞内寄生的革兰阳性短杆菌，是李斯特菌属中可引起人兽共患性疾病的一种病原菌，广泛存在于自然界中，因其容易污染饲料、土壤、水源等而成为食品业中重要的污染源。新生儿和成年人感染后通常表现为脑膜炎和败血症，怀孕妇女感染后常表现为发热和流产。目前李斯特菌感染主要应用抗生素进行治疗，该菌对大多数抗生素都较敏感，但近年来不断出现关于单增李斯特菌对一种或多种抗生素耐药的报道 。为更好的了解我国食源性单增李斯特菌对常用抗生素的耐药情况，本文对2005 - 2011年7个省市/地区食品中分离的单增李斯特菌进行药物敏感性试验检测，并对相关耐药基因在这些菌株中的携带情况进行了分析。
1 材料与方法
1.1 菌株
　　203株单增李斯特菌分别于2005 - 2011年自安徽、上海、北京、湖北、福建、浙江、四川7个省(直辖市)的食品中分离获得。药敏质控菌株为肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)ATCC49619。
1.2 仪器与试剂
　　 生化培养箱，电子天平，高压灭菌锅。脑心浸液培养基、细菌琼脂粉(北京陆桥技术有限责任公司)、微量细菌定量药敏(MIC)试剂盒(天津市金章科技发展有限公司)。细菌基因组提取试剂盒及PCR 2×Taq MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司。Goldview DNA染料、DNAMarker购自大连宝生物工程有限公司。Labcycler PCR仪购自德国圣欧国际有限公司，电泳槽购自北京博思公司，Gel Doc XR 凝胶成像仪购自美国伯乐公司。
引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列见表1。
1.3 方法
1.3.1 药物敏感性试验
　　按照美国临床实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI)推荐的单增李斯特菌及非肠道菌群药敏试验

表1 耐药基因检测引物
Table 1 Primers for detection of antibiotic resistant genes
基因名称引物序列(5′~3′)   基因编码功能   退火温度(℃)产物大小(bp)
tetAF:GCT ACA TCC TGC TTG CCT TC
R:CAT AGA TCG CCG TGA AGA GG		四环素类耐药55220
tetSF:CAT AGA CAA GCC GTT GAC C
R:ATG TTT TTG GAA CGC CAG AG		四环素类耐药55667
tetMF:CTA CTG ATT TCT GCA AAA GA
R:ATA AGC TCT ATC AAT CTT AC		四环素类耐药46613
ermBF:CTA TCT GAT TGT TGA AGA AGG ATT
R:GTT TAC TTT TGG TTT AGG ATG AAA		大环内酯类耐药52142
ermCF:GCT AAT ATT GTT TAA ATC GTC AAT
R:TCA AAA CAT AAT ATA GAT AAA		大环内酯类耐药42640
aac(6′)-IbF:TTG CGA TGC TCT ATG AGT GGC TA
R:CTC GAA TGC CTG GCG TGT TT		氨基糖苷类耐药58481
mecAF:TAG AAA TGA CTG AAC GTC CG
R:TTG CGA TCA ATG TTA CCG TAG		β-内酰胺类耐药54154
vanAF:GGG AAA ACG ACA ATT GC
R:GTA CAA TGC GGC CGT TA		万古霉素耐药50732
vanBF:TTG ATG TGG CTT TCC CGG TT
R:ACC CGA TTT CGT TCC TCG AC		万古霉素耐药55544
Xis-TnF:ATG AAG CAG ACT GAC ATT CC
R:TTC GTT TAA TCT GAA TAC GA		Tn916转座子切除酶52164
Int-TnF:GAC TGG AGA GAG CCA ACG AA
R:CAT CAT GCC GTT GTA ATC AC		Tn916转座子合成酶54900


抗生素选择原则，结合临床用药和研究需要，共选择20种抗生素。采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法(broth microdilution susceptibility testing)进行药物敏感性试验。
1.3.1.1 菌株活化
　　将-80 ℃保存的单增李斯特菌接种于脑心浸液肉汤中，37 ℃过夜培养，将肉汤培养物划线接种于脑心浸液琼脂平板，37 ℃培养24 h。
1.3.1.2  菌液制备
　　在脑心浸液琼脂平板18~24 h 培养物挑取3～5个单增李斯特菌菌落，均匀悬浮于1.5 ml细菌稀释管中，使用0.5麦氏比浊管为对照，将该菌液调整至0.5麦氏单位的浓度，使菌液中的细菌含量达到1×108cfu/ml。
1.3.1.3 菌液接种
　　在生物安全柜内使用微量移液器吸取10 μl用比浊仪调好浓度的菌液加入到10 ml肉汤管中，混匀并缓慢倾倒入“V”形无菌槽内。使用微量移液器依次加入到96孔药敏板中，吸头不要接触孔内冻干药粉，避免药物相互作用。盖上无菌盖，接种完毕，最终接种细菌浓度约为1~2×105 cfu/ml。
1.3.1.4 孵育
　　在接种菌液之后，将药敏试剂盒置于垫有湿纱布的37 ℃温箱中，孵育16~20 h。质控菌株肺炎链球菌ATCC49619在微需氧条件下37 ℃培养16~20 h。
1.3.1.5 观察结果
　　在衬有黑底板的光线下用肉眼观察。有细菌生长的小孔中，呈弥散状浑浊或小孔底部有圆形或网状沉淀；在无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。参照CLSI药敏标准(M45-A)表10及(M100-S17)的解释标准进行结果判定。
1.3.2  耐药基因的检测
　　按照DNA提取试剂盒说明进行菌株DNA模板的制备。本文针对四环素类抗生素耐药基因tetM、tetS、tetA、β-内酰胺类抗生素耐药基因mecA，氨基糖苷类抗生素耐药基因aac(6′)-Ib等9种常见耐药基因对实验菌株进行了PCR检测，并对tetM基因检测阳性的菌株进行接合型转座子Tn916特有基因的检测，引物序列见表1 。PCR反应体系包括2×Taq MasterMix 10 μl、上游引物P1和下游引物P2各1 μl、细菌DNA模板1 μl、去离子水7 μl，总反应体积为20 μl。PCR反应参数：94 ℃预变性5 min，循环94 ℃变性30 s，各检测基因根据表1中退火温度退火30 s；72 ℃延伸1 min，30个循环后，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物取5 μl点样于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，置凝胶成像系统读取检测结果，并对阳性PCR产物进行测序(由上海生物工程有限公司完成)。
2 结果
2.1  单增李斯特菌的药敏试验结果
　　对203株单增李斯特菌进行20种抗菌药物的药敏试验，结果显示有3株菌对所有抗菌药物均敏感，其余菌株均出现不同程度的耐药情况。耐受一种抗菌药物的菌株有44株，同时耐受两种抗菌药物的菌株有73株，同时耐受两种以上抗菌药物的药株83株。 对四环素耐药的菌株有5株，其中4株同时出现对强力霉素耐药，1株为中度敏感(MIC 为8 μg/ml)， 2株菌对环丙沙星及诺氟沙星同时耐药并对左氧氟沙星中度敏感，1株菌对氯霉素耐药，对万古霉素、亚胺培南呈中度敏感菌株各1株。本研究中，食源性单增李斯特菌共对多粘菌素B、呋喃妥因、头孢呋肟、氯林可霉素、四环素、强力霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氯霉素9种抗菌药物发生耐药，耐药率分别为98.52%、55.66%、50.25%、12.81%、2.46%、1.97%、0.99%、0.99%和0.49%。实验菌株对各抗菌药物的敏感情况及耐药种类见表2、3。

表2 203株单增李斯特菌耐药检测结果
Table 2 Result of drug susceptibility test of 203 Listeria monocytogenes isolates
耐受抗菌药物种类耐药谱菌株数构成比(%)
0敏感31.48
1多粘菌素B4421.68
2多粘菌素B、呋喃妥因3718.23
2多粘菌素B、氯霉素10.49
2多粘菌素B、头孢呋肟3416.75
2多粘菌素B、氯林可霉素10.49
3多粘菌素B、呋喃妥因、氯林可霉素104.93
3多粘菌素B、四环素、强力霉素20.98
3多粘菌素B、呋喃妥因、四环素10.49
3多粘菌素B、头孢呋肟、呋喃妥因5225.62
3多粘菌素B、头孢呋肟、氯林可霉素41.97
4多粘菌素B、呋喃妥因、环丙沙星、诺氟沙星10.49
4多粘菌素B、头孢呋肟、呋喃妥因、氯林可霉素104.93
4多粘菌素B、头孢呋肟、四环素、强力霉素10.49
5多粘菌素B、呋喃妥因、四环素、强力霉素、氯林可霉素10.49
5多粘菌素B、头孢呋肟，呋喃妥因、环丙沙星、诺氟沙星10.49


表3 单增李斯特菌的20种抗菌药物药敏结果
Table 3 Drug susceptibility of Listeria monocytogenes isolates to 20 antibiotics
抗菌药物种类 MIC判定标准(μg/ml) MIC范围(μg/ml) 敏感性(%)
中敏 耐药 中敏 中介 耐药
庆大霉素8≥160.064～4100.000.000.00
氨苄西林16≥320.125～4100.000.000.00
青霉素-≥160.125～8100.000.000.00
四环素8≥160.064～≥6497.540.002.46
强力霉素8≥160.064～1697.540.491.97
亚胺培南8≥160.064～899.510.490.00
红霉素1～4≥80.032～288.6711.330.00
环丙沙星2≥40.016～491.137.880.99
左氧氟沙星4≥80.032～496.063.940.00
头孢噻吩16≥320.125～8100.000.000.00
利福平2≥40.016～0.5100.000.000.00
万古霉素8～16≥320.125～899.510.490.00
氯霉素16≥320.125～3299.020.490.49
复方新诺明-≥4/760.016/0.3～2/38100.000.000.00
氨苄西林/舒巴坦8～16≥32/160.125/0.064～4/2100.000.000.00
诺氟沙星8≥160.015～≥1696.052.960.99
头孢呋肟16≥320.06～≥6435.4714.2950.25
多粘菌素B4≥80.03～≥641.480.0098.52
呋喃妥因64≥1280.25～≥25634.989.3655.66
氯林可霉素1～2≥40.03～817.7369.4612.81


2.2 不同年份单增李斯特菌的耐药情况
　　2005 - 2011年食品中分离的单增李斯特菌对四环素、强力霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氯霉素、头孢呋肟、多粘菌素B、呋喃妥因、氯林可霉素9种抗菌药物耐药，其余抗菌药物均未出现耐药现象，见表4。
2.3  不同地区单增李斯特菌的耐药情况
　　本研究中单增李斯特菌分离自安徽、福建、四川、湖北、浙江、北京、上海7个省(直辖市)的食品，各地区菌株均出现对多种抗菌药物耐药情况，见表5。
2.4 耐药基因及转座子Tn916的检测结果
　　203株单增李斯特菌中，5株四环素耐药菌株均检测出tetM基因，其中3株菌株的Tn916特有基因(Int-Tn基因、Xis-Tn基因)检测结果阳性，基因tetA、tetS、ermB、ermC、vanA、vanB、mecA、aac(6′)-Ib在所有实验菌株中的检测结果均为阴性。

表4 不同年份食品中分离单增李斯特菌的抗菌药物耐药情况
Table 4 Drug susceptibility of Listeria monocytogenes strains isolated in different years
抗菌药物 2005年 2006年 2007年 2008年 2009年 2010年 2011年
耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数
四环素035223028252029025111
强力霉素035223028152029025111
环丙沙星135123028052029025011
诺氟沙星135123028052029025011
氯霉素035023028052129025011
头孢呋肟213511231428245211291825311
多粘菌素B3535222327285252282925251111
呋喃妥因30356231328345214291125411
氯林可霉素3353230281152329425211
多重耐药203582392825528291025411


表5 不同地区单增李斯特菌的耐药情况
Table 5 Drug susceptibility of Listeria monocytogenes strains isolated from different areas
抗菌药物 安徽省 湖北省 北京市 四川省 福建省 上海市 浙江省
耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数 耐药株数 总株数
四环素13423603301808128146
强力霉素03423603301808128146
环丙沙星03423603301808028046
诺氟沙星03423603301808028046
氯霉素03403603301808128046
头孢呋肟2134183613338185810282746
多粘菌素B34343536333317188827284646
呋喃妥因183416361833918888283646
氯林可霉素53443683301828328446
多重耐药163414361133518688282346


3 讨论
　　通常单增李斯特菌对青霉素、氨基糖苷类抗生素、甲氧苄氨嘧啶、四环素、大环内酯类抗生素及万古霉素敏感，但对头孢菌素类抗生素以及第一代喹诺酮类抗菌药物敏感性下降甚至出现抗性，对氟喹诺酮类抗菌药物仍然敏感。目前李斯特菌感染主要采用支持疗法，静脉注射青霉素或氨苄西林并联合氨基糖苷类抗生素(如庆大霉素)，对青霉素过敏的患者可使用万古霉素、替考拉宁、甲氧苄氨嘧啶或新诺明[8]。单增李斯特菌目前尚未出现对临床一线抗菌治疗药物耐药的报道，但对环丙沙星、红霉素等二线药物、四环素类抗生素的耐药菌株已相继出现 。本研究所检测的单增李斯特菌株对多粘菌素B、头孢呋肟和呋喃妥因耐药严重，其次为氯林可霉素，对一线药物尚未出现耐药情况，而对环丙沙星、诺氟沙星同时出现耐药性。此外，对红霉素(中介率为11.33%)、左氧氟沙星等多种抗生素呈中度敏感，对亚胺培南及万古霉素也出现中度敏感，但对头孢噻吩仍然敏感。
目前关于单增李斯特菌对四环素及红霉素耐药的报道较多[12]，相关耐药基因的研究也较深入。编码四环素类耐药的基因较多，主要通过编码外输泵蛋白、核糖体保护蛋白、灭活或钝化四环素的酶从而致使细菌对四环素耐药。目前在单增李斯特菌中已发现的四环素耐药基因有tetM、tetS、tetL[1]，接合型转座子Tn916则是在不同细菌间散播四环素抗性基因tetM的重要载体。已发现较常见的红霉素耐药基因ermB、ermC编码红霉素甲基化酶，使红霉素作用靶位发生变化，从而对该抗生素产生抗性。本研究中，对四环素类耐药基因tetM、tetS、tetA，红霉素耐药基因ermB、ermC，万古霉素耐药基因vanA、vanB，β-内酰胺类耐药基因mecA以及能同时编码喹诺酮类和氨基糖苷类耐药的基因aac(6′)-Ib在203株单增李斯特菌中的存在情况进行了检测，仅检测到四环素耐药基因tetM。Tn916是于1981年在粪肠菌中发现的第一个接合型转座子，携带tetM基因、Int-Tn基因和Xis-Tn基因，分别编码四环素耐药蛋白TETM、整合酶和切除酶[13]，目前测定Int-Tn基因是检验Tn916存在的常用方法[14]。在本研究中出现5例菌株对四环素耐药，其中4株菌株同时对强力霉素耐药，均检测出tetM基因，其中3株同时检测出Int-Tn基因和Xis-Tn基因，并且未检测出其他四环素耐药相关基因，提示我国单增李斯特菌对四环素耐药主要由Tn916转座子所携带的tetM基因编码。携带有耐药基因接合型转座子在细菌间的水平传播以及环境中耐药质粒的普遍存在促进了耐药菌株的产生，给临床感染病例的治疗带来一定困难。
本研究检测的203株单增李斯特菌来自我国7个不同省(市)，均为食品分离株，分别来源于生牛肉、生猪肉、生禽肉、水产品、蔬菜、熟食及面食等。本研究发现，单增李斯特菌对头孢呋肟、多粘菌素B、呋喃妥因、氯林可霉素耐药情况较为严重，是双重耐药、多重耐药菌株主要的耐药对象，通过χ2检验对这5种抗生素耐药菌株，以及多重耐药菌株在时间上和地点间分布情况进行统计学分析发现，对头孢呋肟、多粘菌素B、氯林可霉素耐药菌株和多重耐药菌株的分布情况在时间上和地区间的差异无统计意义，而呋喃妥因在时间上及地区间耐药分布差异有统计学意义(P<0.05)。2006年分离的菌株对呋喃妥因耐药率最低，耐药菌株均来自湖北省，2005年菌株对呋喃妥因耐药率最高，这些菌株分别来自福建、浙江和湖北省。从地区分布分析，浙江省、北京市分离的菌株对呋喃妥因耐药率较高，上海市分离菌株对呋喃妥因耐药率最低。同时对呋喃妥因耐药的菌株主要分离自生猪肉、生禽肉和牛羊肉，提示我国食源性单增李斯特菌对抗生素呋喃妥因的耐药分布与菌株分离时间、地点、食品种类具有一定相关性。此外，对四环素、环丙沙星、诺氟沙星及氯霉素也已出现散在耐药情况，提示我国单增李斯特菌的耐药谱较广。虽然对一线治疗药物尚未出现耐药情况，但这些菌株广泛的耐药情况应引起人们关注，可能与动物饲料中抗生素的添加以及生产加工环境同时存在其他携带耐药基因的病原菌污染有关。
鉴于目前存在滥用抗生素的情况，应进一步加强对我国单增李斯特菌的耐药性检测及耐药机制研究，严格动物饲料行业中抗生素使用的管理，加大对食品生产、加工过程及销售环节的卫生监督，规范临床感染病例的抗生素治疗，预防及控制单增李斯特菌对抗生素耐药性的产生，从而保障人们的健康。

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