内蒙古自治区是中国最大的少数民族聚居区之一^[1]，也是中国结核病高发地区之一，其结核分枝杆菌串联重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)基因多态性及其基因型分布状况相关研究尚未见报道。因此，对该地区的结核分枝杆菌开展VNTR基因多态性研究，可有效的提高该地区的结核病防控水平。
随着分子生物学技术的发展，结核分枝杆菌分子分型的方法在探讨结核病的传播特征、追踪传染源、监测可疑暴发及研究遗传相关性方面具有重要的科学实用性^[2]。其中，基于分枝杆菌数目可变串联重复序列(mycobacterial interspersed repetitive units-variable number tandem repeat， MIRU-VNTR)的结核分枝杆菌分型方法，因其分辨率、敏感性、特异性和重复性均较高，且结果数字化，易于比较等优势，成为结核病流行病学研究中应用较为广泛的方法之一。目前，由于世界各地结核分枝杆菌基因型的差别较大，因此MIRU-VNTR分型位点的选择尚未有一致的标准。我们根据中国目前已有的文献报道，选取22位点，对内蒙古地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型，旨在对该地区结核病分子流行病学进行研究，从而为该地区结核病传染源的追溯、传播机制及菌株遗传学关系等的研究提供理论基础。 1.1 菌株
　　 372株结核分枝杆菌来源于2011年内蒙古自治区结核病防治研究所临床病例痰标本。其中316个新发病例，56个复治病例；男性245例，女性124例，3例性别不详。汉族282例，蒙古族84例，回族4例，维吾尔族1例，满族1例。结核分枝杆菌标准菌株H37Rv由中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所结核病实验室提供。
1.2 主要试剂
　　2×PCR Taq MasterMix和100 bp Ladder购自北京康为世纪生物科技有限公司；引物合成由上海生物工程技术服务有限公司进行；L-J培养基由中国CDC传染病预防控制所结核病实验室制备提供。
1.3 DNA 提取
　　 取一菌环L-J培养基斜面上生长的结核分枝杆菌，置于400 μl TE 缓冲液中，沸水浴20 min，12 000 r/min 离心5 min，取上清置于-20 ℃保存备用。
1.4 多位点串联重复序列分析(MLVA)
1.4.1 聚合酶链反应(PCR)反应体系
　　选取22个MIRU-VNTR位点，见表1。采用12 μl反应体系：上下游引物(5 μmol/L)各1 μl，DNA模板2 μl，2×PCR Taq MasterMix 6 μl，2 μl RNase-Free水。PCR反应条件为94 ℃ 10 min， 94 ℃ 30 s， 62 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环，终止延伸10 min。PCR反应引物参考文献[3]，具体见表1。
1.4.2  凝胶电泳分析
　　PCR扩增产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统进行拍照，Image Lab 软件对电泳条带进行分析，计算重复片段数。
1.5 统计学处理
　　将所有菌株的VNTR位点进行Excel录入，经BioNumerics软件进行聚类。计算各VNTR位点的分辨指数HGDI，公式如下：
HGDI=1-1/N(N-1)∑ s j=1 nj(nj-1)
式中N为菌株总数，S是总基因型数，n_j代表第j类基因型的菌株数^[4]。
分析基因型完全相同的菌株，定义为一簇。成簇率的计算如下：(n_c-c)/n,n_c代表成簇的菌株数，c为成簇数，n为总菌株数。 2.1 聚类分析
　　 根据MIRU-VNTR分型结果，BioNumerics进行聚类，372株菌共表现出308个基因型，其中261株菌表现为独特基因型，111株表现为47簇，成簇率为17.20%，具体聚类分析见图1。
2.2 22位点多态性分析
　　利用Hunter-Gaston(HGDI)指数评价各VNTR位点的基因多态性，根据 文献报道^[5]，基于HGDI 的不同，VNTR位点可分为高分辨率(HGDI>0.6)、中分辨率(0.3<HGDI<0.6)和低分辨率(HGDI<0.3)。 在本实验中，VNTR3820、 Qub11b、Qub18、 Qub11a、 Mtub21 和 Qub26等6个位点的HGDI均大于0.6，属于高分辨率位点；MIRU26、Mtub04、ETRA、ETRE、MIRU10、Mtub30、MIRU39和Qub4156c等8个位点的HGDI在0.3~0.6之间，属于中分辨率位点，而剩下的则分辨率较低。22位点累计HGDI为0.9902。具体各位点HGDI值见表2。
2.3 基因群与内蒙古地区主要民族易感性分析
　　 根据聚类分析，372株结核 分枝杆菌主要 分为5大基

表1 各重复位点在H37Rv中的重复次数、重复片段大小及其引物序列
Table 1 Primer sequence， size of repeats and number of repeats in M. tuberculosis H37Rv

序号	名称	引物序列(5′~3′)	重复片段大小 (bp)	重复次数	扩增片段大小 (bp)
1	ETRA	L) ATT TCG ATC GGG ATG TTG AT R) TCG GTC CCA TCA CCT TCT TA	75	3	397
2	ETRB	L) GCG AAC ACC AGG ACA GCA TCA TG R) GGC ATG CCG GTG ATC GAG TGG	57	3	292
3	ETRC	L) GAC TTC AAT GCG TTG TTG GA R) GTC TTG ACC TCC ACG AGT GC	58	4	346
4	ETRD	L) GCG CGA GAG CCC GAA CTG C R) GCG CAG CAG AAA CGT CAG C	77	3	330
5	ETRE	L) ACT GAT TGG CTT CAT ACG GCT TTA R)GTG CCG ACG TGG TCT TGA T	53	3	651
6	MIRU10	L) GTT CTT GAC CAA CTG AGT CGT CC R) GCC ACC TTG GTG ATC AGC TAC CT	53	3	643
7	MIRU16	L) TCG GTG ATC GGG TCC AGT CCA AGT A R) CCC GTC GTG CAG CCC TGG TAC	53	2	671
8	MIRU23	L) CAG CGA AAC GAA CTG TGC TAT CAC R) CGT GTC CGA GCA GAA AAG GGT AT	53	6	873
9	MIRU26	L) CCC GCC TTC GAA ACG TCG CT R) TGG ACA TAG GCG ACC AGG CGA ATA	51	3	613
10	MIRU27	L) TCG AAA GCC TCT GCG TGC CAG TAA R) GCG ATG TGA GCG TGC CAC TCA A	53	3	657
11	MIRU39	L) CGC ATC GAC AAA CTG GAG CCA AAC R) CGG AAA CGT CTA CGC CCC ACA CAT	53	2	646
12	MIRU40	L) GGG TTG CTG GAT GAC AAC GTG T R) GGG TGA TCT CGG CGA AAT CAG ATA	54	1	407
13	Mtub21	L) AGA TCC CAG TTG TCG TCG TC R) CAA CAT CGC CTG GTT CTG TA	57	2	206
14	Mtub30	L) AGT CAC CTT TCC TAC CAC TCG TAA C R) ATT AGT AGG GCA CTA GCA CCT CAA G	58	2	319
15	Mtub39	L) AAT CAC GGT AAC TTG GGT TGT TT R) GAT GCA TGT TCG ACC CGT AG	58	6	515
16	Qub11a	L) CCC ATC CCG CTT AGC ACA TTC GTA R) TTC AGG GGG GAT CCG GGA	69	3	305
17	Qub11b	L) CGT AAG GGG GAT GCG GGA AAT AGG R) CGA AGT GAA TGG TGG CAT	69	5	412
18	Qub4156c	L) TGG TCG CTA CGC ATC GTG TCG GCC CGT R) TAC CAC CCG GGC AGT TTA C	59	3	224
19	Qub18	L) ATC GTC AGC TGC GGA ATA GT R) AAT ACC GGG GAT ATC GGT TC	78	6	621
20	Qub26	L) AAC GCT CAG CTG TCG GAT R) GGC CAG GTC CTT CCC GAT	111	5	708
21	Mtub04	L) GTC CAG GTT GCA AGA GAT GG R) GGC ATC CTC AAC AAC GG TAG	51	3	269
22	VNTR3820	L) TGC GCG GTG AAT GAG ACG R) ACC TTC ATC CTT GGC GAC	57	3	409

因群(Ⅰ群257株，Ⅱ群46株，Ⅲ群25株，Ⅳ群38株，Ⅴ群10株，分别占69.09%、12.37%、4.03%、10.22%和2.69%)，其他为单个独立菌株。其中282例为汉族，84例为蒙古族，且Ⅰ群257株，因此分析两个主要民族与Ⅰ群基因型菌株的易感性，χ²检验显示，两个民族间的Ⅰ群基因型菌株与非Ⅰ群基因型菌株差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。 　　内蒙古自治区在中国属于结核病严重流行地区之一。早在1990年全国结核病流行病学调查显示，内蒙古地区结核病的流行率仅次于西藏和四川，居全国第3位，且高于1979年的调查数据^[6]。因此，对该地区结核分枝杆菌分子流行病学开展研究具有重要的意义。

图1 内蒙古自治区372株结核分枝杆菌BioNumerics聚类分析图
Figure 1 BioNumerics analysis of 372 M. tuberculosis isolates from Inner Mongolia

表2 22个VNTR位点在372株结核分枝杆菌中不同的Hunter-Gaston 指数
Table 2 HGDI scores of 22 MIRU-VNTR loci for 372 M. tuberculosis isolates

序号	位点	HGDI	序号	位点	HGDI
1	VNTR3820	0.838	13	MIRU39	0.327
2	Qub11b	0.756	14	Qub4156c	0.316
3	Qub18	0.706	15	MIRU40	0.299
4	Qub11a	0.663	16	Mtub39	0.285
5	Mtub21	0.655	17	MIRU16	0.204
6	Qub26	0.624	18	ETRB	0.194
7	MIRU26	0.548	19	ETRD	0.134
8	Mtub04	0.461	20	ETRC	0.127
9	ETRA	0.425	21	MIRU27	0.083
10	ETRE	0.402	22	MIRU23	0.068
11	MIRU10	0.388	23	cumulative HGDI	0.9902
12	Mtub30	0.334

表3 Ⅰ群基因型菌株与主要民族间易感性分析
Table 3 Correlation between VNTR Ⅰgenotype and ethnic groups

民族	Ⅰ群基因型 菌株数	其他基因型 菌株数	合计 (菌株数)
汉族	192	90	282
蒙古族	60	24	84
合计	252	114	366

  注：χ²=0.337, P=0.561>0.05。

通过MIRU-VNTR分型显示，本研究372株结核分枝杆菌共表现出308个基因型，其基因多态性明显，其中261株菌表现为独特基因型，111株表现为47簇，成簇率为17.20%。较spologotyping(另文发表)结果比较，分型结果明显较好。内蒙古作为中国少数民族聚居最多的地区，其结核病分子流行病学的基因多态性表现对于民族易感性的研究具有一定意义。
MIRU-VNTR分型是结核分枝杆菌基因分型应用较广泛的方法之一，但在不同地区，由于结核分枝杆菌基因型的差别，其VNTR位点的选择亦具有不同的差异性。常用的MIRU-VNTR分型包括12位点、15位点和24位点组合，其分辨率因位点组合的不同而不同 。据最新文献报道 ，日本、尼日利亚和北俄罗斯分别采用JATA-VNTR、 24 VNTR和 15 VNTR(12 VNTR加3高变位点)组合来分析各自地区的结核分枝杆菌及其北京家族菌株，其分辨率均较高。由此可见，各地区VNTR分型位点的选择各有差异，其依据为该地区结核分枝杆菌 流行的主要基因型。在本实验中，选取的22位点是在先前其他省份的研究基础上 ，挑选多态性较高的位点，对菌株进行分析。累积分辨率为0.9902。
基于统计学数据，内蒙古自治区2007年人口调查显示78%的人口为汉族，18%的为蒙古族，且蒙古族的比例在逐年上升^[14]。在本研究中，蒙古族和汉族人口的比例分别为22.58%、75.81%，符合人口基本状况，因此统计学分析是有意义的。而其他少数民族由于人口比例较低，不满足统计学要求，而未纳入统计分析中。有关Ⅰ群基因型菌株易感性和主要民族相关性分析显示，内蒙古地区结核分枝杆菌Ⅰ群基因型菌株的感染与汉族和蒙古族无关，同时由于菌株来源在各区分布不一致，因此未能有效讨论内蒙古不同地理与结核病的流行状况相关性。
综上所述，对于内蒙古地区结核分枝杆菌的基因型构成及流行株有了初步了解，这对今后的结核病防控工作有一定的指导意义。另外，还需对该地区北京家族的流行及其耐药等多方面进行深入研究探讨，才能更好的提高结核病的防控水平。

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