疾病监测, 2013, 28(4): 300-302
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.4.014
Factors influencing virus isolation during sample collection from influenza-like illness cases in Shiyan, Hubei
MEI Yu-fa, WANG Xi-yun, CUI Long, LIU Lan-fang
Shiyan Center for Disease Control and Prevention, Shiyan 442000, Hubei, China
Abstract
Objective To understand the factors influencing the virus isolation during sample collection from influenza like illness(ILI) cases in Shiyan, Hubei province, and provide evidence for the improvement of influenza etiological surveillance. Methods The analysis was conducted on the quality of the clinical samples of ILI cases sent by 2 sentinel hospitals in Shiyan between January and October 2012. Results The quality of the samples collected from children was better than that from adults, the positive rate of the samples collected within 1-2 days after onset was highest, the difference in the positive rate of the samples collected at different days had statistical significance(χ2=21.145, P=0.001). The samples stored at-20℃ for less than 4 days had a positive rate of>60%. Conclusion The quality of clinical samples and store and transport conditions are the important factors related to the success of influenza virus isolation.
Keywords:    influenza-like illness cases   sample   collection   store   detection   influential factor  

湖北省十堰市流感样病例标本采集对病毒分离效果影响因素分析
梅玉发, 王喜云, 崔龙, 刘兰芳
十堰市疾病预防控制中心, 湖北 十堰 442000
摘要
目的 探讨流感样病例标本采集对病毒分离效果的影响因素,提高流感病原学监测质量。 方法 对2012年1-10月十堰市2家哨点医院送检的流感样病例标本进行质量分析。 结果 儿童监测点标本质量比成年人监测点标本质量高;发病后第1~2天采集的标本细胞分离阳性率最高,不同发病天数采集的标本阳性率差异有统计学意义(χ2=21.145, P=0.001);标本采集后于-20℃冰柜保存时间在4 d以内,阳性率均在60%以上,不会影响病毒的MDCK细胞分离。 结论 临床标本采集的质量及其保存运输等环节是病毒分离成功与否的主要影响因素。
关键词:    流感样病例   标本   采集   保存   检测   影响因素  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 标本采集与保存
1.2 标本的运送
1.3 标本的检测
1.4 主要试剂器材
1.4.1 采样管
1.4.2 核酸检测
1.4.3 细胞培养
1.5 数据分析
2 结果
2.1 标本采集数量
2.2 不同来源标本检测情况
2.3 采样时发病天数与检测结果的关系
2.4 采集后医院保存天数与检测结果的关系
3 讨论
　　流行性感冒(流感)一直是严重的全球性公共卫生问题，也是第一个实行全球性监测的传染病[1]。我国被公认为全球流感的多发地，现已成为国际流感监测的前沿[2]。开展流感监测，不仅可以及时掌握流感流行趋势，为制定流感防制策略提供科学依据，还能及时发现有意义的变异株，为更新流感疫苗提供科学依据。获得合格的流感样病例(ILI)标本，及时分离出流感病毒，是流感监测网络实验室最核心的工作。现对2012年十堰市两家流感监测哨点医院ILI标本的采集、流转及检测情况进行介绍，并做质量评估。
1 材料与方法
1.1 标本采集与保存
　　十堰市太和医院与市人民医院分别为该市儿童和成人ILI监测哨点。太和医院儿童医院门诊与儿童急诊科、人民医院感染性疾病科与急诊科医护人员分别负责儿童与成年人的标本采集。采样管由市疾病预防控制中心(CDC)提供。医院可全天候采样，标本采集后置-20 ℃冰柜保存。
1.2 标本的运送
　　每周采集送检ILI病例标本均在5份以上，每周一与周三，两家医院派专人将已采集标本于4 ℃运输箱内送至市CDC病毒室。
1.3 标本的检测
　　标本接收后先置-80 ℃冰柜冻存，于该周四上午进行流感病毒的核酸检测，并按要求加双抗处理，下午挑出核酸检测阳性的标本接种MDCK细胞，进行病毒分离。
1.4 主要试剂器材
1.4.1  采样管
　　以HBSS加入适量BSA与三抗(青霉素、链霉素、两性霉素)后调pH至7.4左右，分装至无菌的螺口塑料管中，每管约2.5～3.0 ml，-20 ℃冻存备用。
1.4.2 核酸检测
　　以QIAGEN核酸提取试剂盒提取RNA，以Invitrogen公司的实量荧光定量反转录聚合酶链反应(rRT-PCR)试剂盒及其合成的引物探针，或者北京金豪公司的成品试剂盒配制反应体系，以ABI7300型Real-time PCR仪扩增。
1.4.3 细胞培养
　　MDCK细胞、流感鉴定分型血清试剂盒由国家流感中心提供；TPCK胰酶由Sigma公司提供；DMEM、PBS、HEPS、BSA及 PS双抗等由GIBCO公司提供；1%人“O”型红细胞悬液由本实验室新鲜配制。
1.5 数据分析
　　将有关数据从“中国流感监测信息系统”导出后，以SPSS 18.0软件进行统计分析，采用χ2检验分析。
2 结果
2.1 标本采集数量
　　2012年1-44周(1月2日至11月4日)，市太和医院与市人民医院，平均每周依次采集16份和11份标本。共采集标本1211份，从中分离出流感细胞株231株，检出率为19.08%。
2.2 不同来源标本检测情况
　　儿童标本由市太和医院采集，成年人标本由市人民医院采集。经核酸检测，两家医院标本阳性率差异有统计学意义 (χ2=12.709， P=0.000)；经MDCK细胞分离，二者阳性率差异也有统计学意义(χ2=22.616， P=0.001)，见表1。

表1 十堰市两所ILI监测哨点医院采集标本的检测结果比较
Table 1 Comparison of detection result of ILI samples from 2 sentinel hospitals in Shiyan
标本来源 采样数(份) 核酸检测 MDCK细胞分离
阳性数(份) 阳性率(%) 阳性数(份) 阳性率(%)
太和医院71322731.8416823.56
人民医院49811222.496312.65
合计121133927.9923119.08


2.3 采样时发病天数与检测结果的关系
　　经核酸检测，不同发病天数采集的标本阳性率差异有统计学意义(χ2=21.145， P=0.001)，发病后第1～3天采样，最易采集到流感病毒阳性标本。核酸阳性标本，经MDCK细胞分离，阳性率差异有统计学意义(经蒙特卡罗模拟方法计算，P=0.017，其99%置信区间为0.014～0.020)， 从发病后第1～2天采样的标本最易分离出流感病毒，见表2。

表2 不同发病时间ILI标本检测结果比较
Table 2 Comparison of detection result of ILI samples collected at different times after onset
发病天数(d) 核酸检测 MDCK细胞分离
标本数(份) 阳性数(份) 阳性率(%) 标本数(份) 阳性数(份) 阳性率(%)
02915217.87522955.77
155817431.1817412873.56
22357732.77775571.43
3732331.51231043.48
430723.337457.14
5~1824625.006583.33
合计121133930.2433923168.14


2.4 采集后医院保存天数与检测结果的关系
　　经核酸检测阳性的标本，以MDCK细胞进行分离，阳性率差异也有统计学意义(经蒙特卡罗模拟方法计算，P=0.014，其99%置信区间为0.011～0.017)，采集后医院于-20 ℃保存时间在4 d以内，阳性率均在60%以上，基本不会影响病毒的MDCK细胞分离，见表3。

表3 医院采集标本保存天数与检测结果比较
Table 3 Comparison of detection result of ILI samples stored for different times
保存天数(d)检测数(份)阳性数(份)阳性率(%)
0675277.61
1885360.23
2624064.52
3584068.97
4514180.39
5~1013538.46
合计33923168.14

3 讨论
　　 自2004年12月起，十堰市常年开展流感监测工作，于2005年10月加入全国流感监测网络。2004-2007年，十堰市流感监测网络实验室每周一上午派人到哨点医院蹲点采样。该模式采集标本新鲜，当日下午即可接种细胞，阳性率较高。期间，检测来自监测哨点医院疑似流感患者鼻咽拭子标本共计1262份，分离出流感病毒219株，检出率为17.35%[3]。但该模式属于突击性集中采样，有时一次采样不足5~15份。该市监测模式多次调整，2012年采用的新模式，运行效果良好。目前实行全周采样，夜间急诊也可采样，虽然中间环节较多，标本采集后置于-20 ℃冰柜保存数天，但采样均衡，易于采集到典型病例标本，检出率达到19.08%。
病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本采集的质量，及其保存运输等环节。该市两家监测哨点医院采集的标本质量差异比较明显，主要原因是采集对象不准，采样技术不过关[4]。把握好采样时机才能采集到高质量的流感标本。发病后第1～3天采样，最易采集到流感病毒，发病第4天后采样阳性率明显下降。发病后第1～2天采集的标本细胞分离阳性率最高，最适合采样，可能与此时患者咽部排毒量最大有关。国家流感监测方案要求[5]， ILI标本采集后要求暂存4 ℃冰箱，并于48 h 内送至网络实验室。 在实际工作中执行有一定的难度。本组数据表明，标本采集后于-20 ℃冰柜保存时间在4 d以内，不会影响病毒的MDCK细胞分离。因此，哨点医院采集的标本可于-20 ℃冰柜保存，间隔3～4 d送样1次，每周2次。这样，既能满足监测工作的质量要求，哨点医院又比较容易接受。

参考文献
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[5] Minisrty of Health of the People's republic of China. Implementation Plan for National Surveillance on Influenza [S]. Beijing:Minisrty of Health of the People's Republic of China,2010.(in Chinese) 中华人民共和国卫生部.全国流感监测方案 [S].北京:中华人民共和国卫生部,2010.