Genotype and drug resistance of CTX-M extended spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Shigella
MIAO Yuan, WANG Yong-quan, CUI Jing-hui, WU Ben-he, WANG Li-ping, LIU Jing, ZHANG Jing-bo
Xicheng District Center for Disease Control and Prevention, Beijing, Beijing 100120, China
Abstract
Objective To understand the genotype and drug resistance of CTX-M extended spectrum beta-lactamases(ESBLs) in clinical isolates of Shigella in Xicheng district of Beijing. Methods Totally 83 strains of clinical isolates of Shigella were colleted in Xicheng district from 2008 to 2011. CTX-M ESBLs was detected by polymerase chain reaction(PCR), then the sequencing for PCR positive products was performed, the sequencing results were aligned with those in GenBank to determine gene subtypes, meanwhile the nucleotide sequence was analyzed by using DNAman software. The drug susceptibility test of the strains carrying CTX-M ESBLs gene to 8 kinds of cephalosporins was performed by Kirby-Bauer method. Results Among 83 strains of Shigella, 13(15.66%) carried CTX-M ESBLs gene. The results of DNA sequence analysis showed that CTX-M ESBLs were all CTX-M-14 subtype, and no single nucleotide polymorphism(SNPs) site was found. The results of drug susceptibility test showed that 13 strains carrying CTX-M ESBLs were resistant to cephalothin, cefazolin and cefotaxime. However, they were sensitive to cefoxitin, ceftazidime, cefepime and cefoperazone, but some strains were resistant to aztreonam. Conclusion The CTX-M ESBLs in Shigella isolated in Xicheng district of Beijing were mainly CTX-M-14 subtype and the gene structure was stable. The strains carrying CTX-M-14 ESBLs showed multidrug resistance.
临床分离志贺菌中产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因型及耐药性分析
苗元, 王永全, 崔京辉, 吴本和, 王利萍, 刘静, 张晶波
北京市西城区疾病预防控制中心检验科, 北京 100120
摘要
目的 了解北京地区临床分离志贺菌携带CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因型及耐药特征。 方法 收集2008-2011年本地区分离出的志贺菌83株,聚合酶链反应(PCR)检测CTX-M型ESBLs耐药基因,明确基因型,阳性产物序列在GenBank上进行比对确定基因亚型,并通过DNAman软件对核酸序列进行分析;对携带CTX-M型ESBLs耐药基因菌株按照Kirby-Bauer法进行药物敏感性试验,测定志贺菌对8种头孢类抗生素耐药情况。 结果 83株志贺菌中,13株携带CTX-M型ESBLs基因,阳性率为15.66%。对DNA序列进行比对、分析均为CTX-M-9型中的CTX-M-14亚型,未发现单核苷酸多态性(SNPs)位点。药敏结果显示,13株携带CTX-M型ESBLs基因菌株对头孢噻吩、头孢唑林、头孢噻肟等头孢类抗生素耐药,对头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟和头孢哌酮等头孢类抗生素均敏感,部分菌株对氨曲南耐药。 结论 本地区志贺菌中CTX-M型ESBLs以CTX-M-14亚型为主,基因结构稳定,携带CTX-M-14型ESBLs菌株呈多重耐药。
内容大纲
-
1 材料与方法
- 1.1 材料
- 1.2 CTX-M型ESBLs耐药基因检测
- 1.3 药物敏感性试验
- 2.1 CTX-M基因PCR检测结果
- 2.2 携带CTX-M型ESBLs耐药基因菌株药敏试验结果
- 2.3 基因序列分析结果
且家族成员日益庞大的新型ESBLs，以对头孢噻肟高水平耐药为主要表型特征，属于Ambler分类中的A类酶，BJM分类中的2be类酶[1]。研究资料显示，CTX-M型ESBLs产酶株的菌谱及地域分布极为广泛，是导致某些地区ESBLs产酶株传播或流行的主要基因型。
由于各地区使用抗生素不同，CTX-M流行基因亚型也有差异。根据编码基因的同源性对比，CTX-M型主要可分为5大组，以CTX-M-1型、CTX-M-2型、CTX-M-8型和CTX-M-9型为主[2]。近年来，随着广谱头孢菌素的广泛使用及ESBLs耐药基因在细菌间的传播，志贺菌中产CTX-M型ESBLs的报道逐渐增多，本研究收集2008-2011年从临床标本中分离出的志贺菌83株进行分析，探讨本地区CTX-M型ESBLs的流行情况及各亚型分布，并对耐药情况进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料收集2008-2011年本辖区内北京儿童医院、北京大学人民医院、北京大学第一医院，积水潭医院等10家肠道门诊开诊期间上送菌株及本实验室从腹泻病患者粪便标本中分离培养的志贺菌共83株，其中福氏志贺菌21株，宋内志贺菌61株，鲍氏志贺菌1株。
1.2 CTX-M型ESBLs耐药基因检测
采用煮沸法提取菌体及质粒DNA。CTX-M型引物序列及反应条件见表1。引物序列由大连(宝)生物工程有限公司合成。PCR扩增在美国Bio-Rad公司的iCycler PCR上进行，PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，美国Bio-Rad公司凝胶成像系统照相。PCR阳性扩增产物委托北京金螺旋生物科技公司纯化、测序。测序使用双脱氧末端终止法，在ABI3730XL测序仪上进行双向测序，序列拼接后通过NCBI BLAST程序在GenBank上查询比较，确定基因亚型。
表1 PCR反应条件及引物序列
Table 1 PCR reaction condition and primer sequence
| 引物名称 | 引物序列(5′~3′) | 扩增长 度(bp) | 退火温 度(℃) |
| CTX-M-1 | GGC CCA TGG TTA AAA AAT CAC TGC
CCG TTT CCG CTA TTA CAA ACC GTT G | 891 | 55 |
| CTX-M-2 | CTC AGA GCA TTC GCC GCT CA
CCG CCG CAG CCA GAA TAT CC | 843 | 55 |
| CTX-M-8 | ATG ATG AGA CAT CGC GTT AAG
CGG TGA CGA TTT TCG CGG CAG | 864 | 55 |
| CTX-M-9 | GTG ACA AAG AGA GTG CAA CGG
ATG ATT CTC GCC GCT GAA GCC | 856 | 60 |
1.3 药物敏感性试验
根据PCR扩增结果，将携带CTX-M型ESBLs耐药基因菌株，按照CLSI推荐的Kirby-Bauer法进行药物敏感性试验测定对8种头孢类抗生素耐药情况。抗菌药物头孢噻吩、头孢唑林、头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南及MH培养基干粉购自英国Oxoid公司。质控菌株使用大肠埃希菌ATCC25922。
2 结果
2.1 CTX-M基因PCR检测结果 83株志贺菌中共有13株检出CTX-M-9型核酸阳性，阳性率为15.66%(13/83)，其他CTX-M型ESBLs未检出。其中11株宋内志贺菌检出携带CTX-M-9型耐药基因，福氏志贺菌检出1株，鲍氏志贺菌检出1株。对核酸阳性的产物进行测序，将测序结果拼接后，在GenBank上经BLAST比对，全部为目的序列，无假阳性出现，基因亚型为CTX-M-14亚型。
2.2 携带CTX-M型ESBLs耐药基因菌株药敏试验结果
根据核酸检测结果，对检出携带CTX-M-14亚型ESBLs耐药基因的13株志贺菌进行药敏试验。实验结果判定根据Oxoid药敏纸片说明书中规定肠杆菌科的抑菌环直径解释标准，判定耐药(R)和敏感(S)。所有携带CTX-M-14亚型ESBLs耐药基因的志贺菌菌株对头孢噻吩、头孢唑林、头孢噻肟等头孢类抗生素耐药，耐药率都达到100%；对头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟和头孢哌酮等头孢类抗生素均敏感，耐药率最高也仅为7.69%；对氨曲南已产生一定耐药性，耐药率为30.77%，见表2。
表2 携带CTX-M型ESBLs耐药基因菌株药敏试验结果
Table 2 Drug susceptibility of strains carrying CTX-M ESBLs gene
| 药物名称 | 耐药菌株 | 耐药率(%) |
| 头孢噻吩(30 μg/片) | 13 | 100.00 |
| 头孢唑林(30 μg/片) | 13 | 100.00 |
| 头孢西丁(30 μg/片) | 0 | 0.00 |
| 头孢噻肟(30 μg/片) | 13 | 100.00 |
| 头孢他啶(30 μg/片) | 0 | 0.00 |
| 头孢哌酮(75 μg/片) | 1 | 7.69 |
| 头孢吡肟(30 μg/片) | 0 | 0.00 |
| 氨曲南(30 μg/片) | 4 | 30.77 |
2.3 基因序列分析结果
以从宋内志贺菌中分离出的DQ350884基因序列作为参考序列，使用DNAman软件分别对13株阳性菌株序列进行比对，分析各序列的SNPs位点及碱基替换。经比对参考序列与本次分离出的13株阳性菌株序列完全一致，无位点差异。
3 讨论
由于各地用药习惯不同，各地检出CTX-M型ESBLs基因型有所差异，上海地区[3]2009年报道检出志贺菌中携带有CTX-M-1和CTX-M-9型耐药基因，河北地区[4]2011报道检出志贺菌中携带有CTX-M-14、CTX-M-3和CTX-M-57型耐药基因，北京地区[5]2010年报道检出志贺菌中携带有CTX-M-1型和CTX-M-9型耐药基因。虽然检出携带CTX-M型ESBLs基因种类有所差异，但都以CTX-M-14亚型为最常见基因型。本研究显示，此次检出的13株携带CTX-M型耐药基因的志贺菌菌株，均为CTX-M-14亚型ESBLs耐药基因，基因型单一，与其他文献报道的检出基因型种类有所差异。
此次13株携带ESBLs耐药基因志贺菌全部检出CTX-M-14亚型，药敏结果显示，13株检出携带CTX-M-14型ESBLs耐药基因的志贺菌株对头孢噻肟100%耐药，对氨曲南的耐药率达到30.77%，而对头孢他啶全部敏感(表2)。近年来，国内外研究显示，CTX-M型ESBLs部分核酸位点发生改变可有效影响对抗生素的作用能力。如：氨基酸序列中的第240位天冬氨酸(Asp)→甘氨酸(Gly)的突变，可扩大CTX-M型ESBLs与头孢他啶的结合部位，促进对头孢他啶的水解[6]。陆坚等[7]对CTX-M-14型ESBLs耐药基因中可能参与酶蛋白质与底物空间构效的氨基酸残基进行了定点突变，结果显示104位天冬酰胺(Asn)→谷氨酸(Glu)突变可显著影响对头孢噻肟的水解能力。本研究对13株阳性产物的核苷酸序列进行分析，发现以上几个决定氨基酸性质的核苷酸位点并未发生突变，而药敏结果也显示13株携带CTX-M-14型ESBLs耐药基因的志贺菌菌株对头孢他啶和头孢噻肟都敏感或都耐药，各菌株对这两种抗生素的耐药性无差异，与其耐药基因型单一，基因结构稳定，在核酸序列上无碱基突变有一定相关性。另外，通过对近几年(2009-2011年)和从不同志贺菌血清型分离出的CTX-M-14型耐药基因序列与2007年提交NCBI的DQ350884序列比对后也未发现核苷酸位点的突变，也表明从志贺菌中分离出的CTX-M-14基因总体结构稳定。然而从药敏结果中也发现有志贺菌株对头孢哌酮和氨曲南等头孢类抗生素的耐药性有差异，经进一步研究发现，部分菌株除携带CTX-M-14型ESBLs耐药基因外还携带其他型ESBLs耐药基因，如OXA、TEM或SHV等ESBLs耐药基因(另文发表)，考虑可能因为菌株随携带ESBLs耐药基因种类的增多，其对头孢类抗生素的耐药性也会增强，耐头孢类抗生素的种类也会增多，万根平等[8]的研究结果也支持此观点。
参考文献
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