疾病监测, 2013, 28(4): 322-325
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.4.020
Surveillance of drug-resistance of Mycobacterium tuberculosis in Quzhou, Zhejiang
ZHANG Jian-min, JIN Wan-er, YANG Rui-jun
Quzhou Center for Disease Control and Prevention, Quzhou 324000, Zhejiang, China
Abstract
Objective To understand the drug resistance of clinical isolated Mycobacterium tuberculosis in Quzhou, Zhejiang province, and provide evidence for the prevention and treatment of tuberculosis.Methods The clinical strains isolated in 6 hospitals in Quzhou in 2010 were identified by differential medium culture method. The drug susceptibility of M. tuberculosis strains was detected with proportion method.Results Among 371 clinical isolated M. tuberculosis strains, 292(78.71%) were sensitive to four first line anti TB drugs(isoniazid, rifampicin, streptomycin and ethambutol), and 337(90.84%) were sensitive to two second line anti TB drugs(ofloxacin, and kanamycin). Among 89 drug resistant strains, 51(13.75%) were single drug resistant, 14(3.77%) were poly-resistant, 21(5.66%) were multidrug resistant and 3(0.81%) were extensive drug resistant. The resistant rate to isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol, ofloxacin and kanamycin was 15.36%, 7.01%, 11.86%, 3.23%, 7.82% and 2.42% respectively. Among 326 patients receiving initial treatment, the resistant rate to isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol, ofloxacin and kanamycina was 10.12%, 2.45%, 8.90%, 1.23%, 3.68% and 1.53% respectively, The non drug resistant and MDR rates were 80.98% and 1.84%. Among 45 patients receiving re-treatment, the resistant rate to isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol, ofloxacin and kanamycin was 53.33%, 40.00%, 33.33%, 17.78%, 37.78% and 8.89% respectively, and the non drug resistant and MDR rates were 40.00% and 33.33%.Conclusion The drug resistance of the clinical isolated M. tuberculosis strains in Quzhou was very serious, and the drug resistant rate was higher in the patients receiving retreatment than in the patients receiving initial treatment, to which close attention should be paid. It is necessary to enhance the implementation of DOTS strategy.
Keywords:    drug susceptibility test   drug resistant tuberculosis   Mycobacterium tuberculosis  

浙江省衢州市结核分枝杆菌耐药监测调查
张建民, 金莞尔, 杨瑞军
衢州市疾病预防控制中心, 浙江 衢州 324000
摘要
目的 了解浙江省衢州市结核分枝杆菌临床分离株耐药状况, 为结核病的防治提供参考依据。 方法 收集2010年全年衢州4县2区6家医院肺结核就诊病例痰标本,用改良罗氏培养基进行病原分离,鉴别培养基培养法进行菌型鉴定。对分离到的结核分枝杆菌采用比例法对4种一线抗结核药物,异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB),和二线抗结核药物氧氟沙星(OFX)、卡那霉素(KM)进行药物敏感性检测,用 SPSS 11.0统计软件进行统计分析。 结果 371 株结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物,INH、RFP、SM和 EMB全部敏感的菌株为292株(78.71%),对二线抗结核药物OFX和KM全部敏感的菌株为337株(90.84%);耐药菌株89株(23.99%),其中,单耐药菌株51株(13.75%),耐多药菌株21株(5.66%),多耐药株14株(3.77%),广泛耐药株3株(0.81%)。结核分枝杆菌对4种一线药物INH、RFP、SM和 EMB的耐药率分别为15.36%(57/371)、7.01%(26/371)、11.86%(44/371)和3.23%(12/371);对2种二线药物OFX和KM的耐药率分别为7.82%(29/371) 和2.42%(9/371)。326例初治患者的耐药率为INH 10.12%(33/326)、RFP 2.45%(8/326)、SM 8.90%(29/326)、EMB 1.23%(4/326)、OFX 3.68%(12/326)、KM 1.53%(5/326),非耐药80.98%(264/326),耐多药1.84%(6/326);45例复治患者的耐药率为INH 53.33%(24/45)、RFP 40.00%(18/45)、SM 33.33%(15/45)、EMB 17.78%(8/45)、OFX 37.78%(17/45)、KM 8.89%(4/45),非耐药40.00%(18/45),耐多药33.33%(15/45)。 结论 衢州市结核分枝杆菌的耐药情况较为严重,每种药物复治患者的耐药率均明显高于初治患者,在制定结核病防控策略时应给予充分重视,同时进一步加强高质量的全程监督短程化疗。
关键词:    药物敏感性试验   耐药结核病   结核分枝杆菌  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株来源
1.1.2 标准菌株
1.1.3 主要试剂
1.2 实验方法
2 结果
2.1 结核分枝杆菌检出率
2.2 抗结核药物耐药情况
2.3 初治患者和复治患者耐药模式
2.4 不同年龄组病例耐药结果
3 讨论
　　在我国，结核病(TB)仍然是最主要的传染性疾病之一，耐药结核发生率高于世界平均水平，这已经引起世界范围的关注[1]。2000年中国进行了第四次全国结核病流行病学抽样调查，结果显示，临床分离结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.TB) 对异烟肼(INH)、链霉素(SM)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、对氨基水杨酸钠(PNB)、氨硫尿6种抗结核药总耐药率为27.8%，初始耐药率18.6%，获得性耐药率46.5%；耐多药率为10.7%。与第2次和第3次全国结核病流行病学抽样调查比较，耐药率呈逐年下降的趋势，但获得性耐药率，特别是异烟肼和利福平耐药率明显升高[2]。因此，对结核分枝杆菌临床分离株进行耐药性检测，采取及时、有效的防治措施，积极预防和控制耐药结核病的流行已经成为中国结防工作的迫切任务 。
本次研究采用抽样调查方法，收集浙江省衢州市2010年肺结核门诊病例痰标本进行分离培养，并对分离到的分枝杆菌菌株进行菌种鉴定实验和药物敏感性实验，研究结果表明了衢州市目前结核分枝杆菌耐药水平。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株来源
　　结核分枝杆菌临床分离株来源衢州市2010年6个县(市、区)肺结核门诊病例，对疑似肺结核病例痰涂片检查阳性者，采用改良罗氏培养基进一步进行痰标本的分枝杆菌分离培养，痰标本用4%NaOH处理后，接种于酸性L-J培养基，37 ℃培养8周后，取生长菌落经抗酸染色证实为抗酸菌，报告为分枝杆菌培养阳性。经PNB生长试验和噻吩-2-羧酸腈(TCH)生长等试验进行菌种(菌群)鉴定，凡PNB生长试验为阳性的判断为非结核分枝杆菌(NTM)，阴性的菌株判断为结核分枝杆菌菌群，然后进行噻吩-2-羧酸腈(TCH)生长试验，阳性的菌株判断为结核分枝杆菌，阴性的菌株判断为牛分枝杆菌。共分离到结核分枝杆菌371株用于本次药物敏感性试验。
1.1.2 标准菌株
　　结核分枝杆菌标准株H37Rv由浙江省疾病预防控制中结核病防治所提供，用于实验对照。
1.1.3 主要试剂
　　酸性罗氏培养基、鉴别培养基PNB、TCH、异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、氧氟 沙星、卡那霉素6项药敏培养基等均为杭州嘉伟生物制品有限公司产品，在有效期内使用。
1.2 实验方法
　　 采用酸性罗氏培养基进行病原分离，鉴别培养基采用PNB和TCH培养法进行菌型鉴定。对分离并经鉴定为结核分枝杆菌后，采用世界卫生组织(WHO)推荐的比例法对4种一线抗结核药物，INH、RFP、SM、EMB， 2种二线抗结核药物氧氟沙星(OFX)、卡那霉素(KM)，进行药物敏感性检测，药物终浓度为异烟肼0.2 μg/ml、利福平40 μg/ml、链霉素4 μg/ml、乙胺丁醇2 μg/ml、氧氟沙星2 μg/ml、卡那霉素30 μg/ml，若耐药百分比大于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药，否则为敏感[5]。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌检出率
　　本试验对肺结核门诊病例进行了痰标本病原学检测，在401份痰涂片抗酸染色检查阳性者痰标本中，共分离到383株分枝杆菌菌株，经菌种鉴定为非结核分枝杆菌12株，结核分枝杆菌371株，牛结核分枝杆菌未检出。
2.2 抗结核药物耐药情况
　　在371株结核分枝杆菌中，初治患者菌株326株，各种药物耐药率如下：异烟肼10.12%、利福平2.45%、乙胺丁醇1.23%、链霉素8.90%、氧氟沙星3.68%、卡那霉素1.53%；同时耐异烟肼和利福平2.15%，同时耐氧氟沙星和卡那霉素0.61%；复治患者菌株45株，各种药物耐药率如下：异烟肼53.33%、利福平40.0%、乙胺丁醇17.78%、链霉素33.33%、氧氟沙星37.78%、卡那霉素8.89%、同时耐异烟肼和利福平37.78%、同时耐氧氟沙星和卡那霉素4.44%；在所有病例中各种药物耐药率如下：异烟肼15.36%、利福平7.01%、乙胺丁醇 30.23%、链霉素11.86%、氧氟沙星7.82%、卡那霉素 2.42%；同时耐异烟肼和利福平6.47%，同时耐氧氟沙星和卡那霉素1.08%，经χ2检验，每种药物的耐药率在初治患者和复治患者中差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
2.3 初治患者和复治患者耐药模式
　　326株初治患者菌株非耐药株264株，占80.98%、单耐药株44株，占13.50%、多耐药株11株，占3.37%、耐多药株6株，占1.84%、广泛耐药株1株，占0.31%；45株复治患者菌株非耐药18株，占40.0%、单耐药7株，占15.56%、多耐药3株，占6.67%、耐多药15株，占33.33%、广泛耐药2株，占4.44%。初治患者菌株的耐药模式以单耐药为主，占13.50%；复治

表1 初治患者和复治患者抗结核药物耐药情况
Table 1 Drug resistance in new TB patients and re-treated TB patients
药物 初治患者 复治患者 合计
耐药数 耐药率(%) 耐药数 耐药率(%) 耐药数 耐药率(%)
INH3310.122453.335715.36
RFP82.451840.00267.01
EMB41.23817.78123.23
SM298.901533.334411.86
OFX123.681737.78297.82
KM51.5348.8992.42
INH+RFP72.151737.78246.47
OFX+KM20.6124.4441.08


患者菌株的耐药模式以耐多药为主，占33.33%，其次为单耐药，占15.56%。初治患者和复治患者对抗结核药物的耐药率差异有统计学意义(χ2=36.42，P<0.05)，见表2。

表2 初治患者和复治患者耐药模式
Table 2 Drug resistant pattern of new TB patients and re-treated TB patients
分类 初治患者 复治患者 合计
耐药数 耐药率(%) 耐药数 耐药率(%) 耐药数 耐药率(%)
单耐药4413.50715.565113.75
多耐药113.3736.67143.78
耐多药61.841533.33215.66
广泛耐药10.3124.4430.81
非耐药26480.981840.0028276.01


2.4 不同年龄组病例耐药结果
　　初治患者对抗结核药物的耐药率平均为19.1%，不同年龄组之间差异无统计学意义(χ2=2.49，P>0.05)。复治患者对抗结核药物的耐药率平均为60.%，其中50～69岁年龄组的耐药率高于平均水平，经χ2检验，不同年龄组的复治患者对结核药物的耐药率差异无统计学意义(χ2=6.42，P>0.05)，见表3。

表3 不同年龄组患者耐药情况
Table 3 Age specific drug resistance of TB patients
年龄组(岁) 病例数 非耐药 单耐药 多耐药 耐多药 广泛耐药
耐药数 耐药率(%) 耐药数 耐药率(%) 耐药数 耐药率(%) 耐药数 耐药率(%) 耐药数 耐药率(%)
≤19
 初治211780.9314.300.014.800.0
 复治000.000.000.000.000.0
20～29
 初治282589.3310.700.000.000.0
 复治100.000.01100.000.000.0
30～39
 初治272177.8622.200.000.000.0
 复治2150.000.0150.000.000.0
40～49
 初治443477.349.136.836.800.0
 复治5360.0120.000.0120.000.0
50～59
 初治574680.7814.035.300.000.0
 复治14428.6214.317.1535.7214.3
60～69
 初治544583.3713.011.911.900.0
 复治9222.2111.100.0666.700.0
70～79
 初治755978.71013.345.311.311.3
 复治10550.0330.000.0220.000.0
≥80
 初治201785.0315.000.000.000.0
 复治4375.000.000.0125.000.0
合计
 初治32626480.94413.5113.461.810.3
 复治451840.0715.636.71533.324.4

3 讨论
　　目前国内大多实验室尚未将菌型鉴定及药敏试验列为常规，将NTM病误认为结核，以致滥用抗结核药致耐多药菌及初始耐药菌增多的现象不可避免。所以，初始耐药菌及NTM菌株的药物依赖情况也要重视。另外，抗酸染色阴性的结核患者存在较为严重的耐药情况也是引起耐药结核菌株流行的重要因素[6]，而这些菌株培养成功率较低，药物依赖情况难以观察，有待于通过分子生物学手段进行基因检测。所以早期有效的选用抗结核药物是成功治疗耐多药结核病的关键。
通过对衢州市2010年6各个县(区)肺结核门诊病例的调查统计，结果耐药结核菌株89例，其中初治患者62例，复治患者27例；耐药患者中单耐药患者所占比例较高；异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇4种一线抗结核药耐药顺序：异烟肼(15.36%)>链霉素(11.86%)>利福平(7.01%)>乙胺丁醇(3.23%)；二线抗结核药物耐药顺序：氧氟沙星(7.82%)>卡那霉素(2.42%)。2010年共检测371株结核杆菌阳性菌株，其中282株为敏感株，89株对1种或1种以上抗结合药物产生耐药性，总体耐药率为23.99%，初始耐药率19.02%，复治患者耐药率60%。与我国2000年全国结核病流行病学调查结果[2](总耐药率27.8%，初始耐药率和复治患者耐药率分别为18.6%和46.5%；耐多药率为10.7%)相比，复治患者耐药率增高明显，初始耐药率基本与之相当，可能与不规则用药、症状改善后患者自行停药，导致结核杆菌获得药物耐受性有关。说明衢州地区的结核病疫情状况不容乐观，所以在制定结核病防控策略时应给予充分重视，同时进一步加强高质量的D0TS。
另外，由于传统的结核药敏试验需要1～2个月的时间，使耐药菌在局部播散，一定程度上影响了结核病患者的治疗。因此耐药结核分枝杆菌的快速鉴定对于结核病的早期诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。结核分枝杆菌基因分型技术 在结核杆菌药物敏感性变化的调查及结核病的传播检测等方面，有着无可比拟的优势，将是我们以后的工作重点。
综上所述，笔者认为，可能由于不规则用药导致结核杆菌获得了药物耐受性，为了实现结核病的“高发现率，高治愈率”的目标， 实验室应以多种方法 联合检测发现结核患者。另外，临床上抗生素的使用最好依据患者的治疗史、实验室的药敏结果结合地区性的结核杆菌耐药情况，尽量采用多种药物联合使用，以避免或延缓结核菌耐药性的产生，从而更好地控制结核病的流行。

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