Characteristics of enteropathogenic Escherichia coli isolated from diarrheal patients in Beijing
GAO Xiang1, ZHAO Hong-qing2, ZHEN Bo-jun1, ZHANG Lan-rong1, ZHANG Chong1, ZOU Lin1, LI Hong-jun1, ZHAO Ai-lan2, WANG Bao-lan1, LIU Xiao-feng1, XIONG Yan-wen2
Tongzhou District Center for Disease Control and Prevention, Beijing, Beijing 101100, China
Abstract
Objective To understand the characteristics of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) isolated from diarrheal patients in Tongzhou district, Beijing. Methods The strains which were eaeA gene positive in PCR amplification were selected to conduct biochemical identification, serotyping, bfpA PCR amplification and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) analysis. Results Only 1 isolate was identified as O126 serogroup from 20 EPEC strains isolated from adult diarrheal patients. Only 1 isolate was identified as O26 serogroup from 4 EPEC strains isolated from diarrheal children. The bfpA genes were negative in all EPEC isolates from children and adults. The PFGE patterns of 23 isolates showed high polymorphism and no obvious relation with age and gender was indicated in the phylogenic tree. Conclusion The EPEC strains isolated from patients in Tongzhou district were mainly atypical EPEC. Detection of EPEC only based on serum group would result in many misdiagnosis.
北京地区腹泻就诊患者中肠致病性大肠埃希菌分离株特征分析
高翔1, 赵红庆2, 甄博珺1, 张兰荣1, 张冲1, 邹林1, 李洪军1, 赵爱兰2, 王宝兰1, 刘晓峰1, 熊衍文2
1. 北京市通州区疾病预防控制中心, 北京 101100;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室
摘要
目的 分析北京市通州区腹泻就诊患者中肠致病性大肠埃希菌(EPEC)分离株的特征。 方法 eaeA基因聚合酶链反应(PCR)扩增阳性的菌株,进行系统生化鉴定、EPEC诊断血清分型、bfpA基因PCR扩增以及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析。 结果 20株成年人腹泻患者EPEC分离株中,仅1株鉴定为O126血清群;4株儿童腹泻患者分离株中,仅1株鉴定为O26血清群。儿童与成年人腹泻患者EPEC分离株bfpA基因均为阴性。23株EPEC菌株的PFGE带型呈高度多态性,聚类图显示与患者年龄及性别无明显相关。 结论 北京市通州区腹泻患者EPEC分离株以非典型为主,单纯通过血清群来诊断EPEC的方法,将会造成极大的漏诊。
内容大纲
-
1 材料与方法
- 1.1 菌株来源
- 1.2 主要试剂
- 1.3 主要仪器
- 1.4 菌株分离鉴定
- 1.5 血清凝集
- 1.6 典型EPEC与非典型EPEC的鉴别
- 1.7 脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)分析
- 2.1 菌株来源情况
- 2.2 血清分型结果
- 2.3 典型EPEC与非典型EPEC鉴定结果
- 2.4 PFGE分型情况
1 材料与方法
1.1 菌株来源 主要来自北京市通州区医院就诊患者，20株肠致病性大肠埃希菌分离自2012年2-10月通州区成年人腹泻就诊患者粪便，另有4株分离自同时期1岁儿童腹泻患者粪便。
1.2 主要试剂
麦康凯培养基、LB培养基为北京陆桥技术有限责任公司产品；API 20E生化鉴定条为bioMérieux产品；致泻性大肠埃希菌诊断血清为宁波天润生物药业有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR反应混合体系为北京康为世纪生物科技有限公司产品；SeaKem Gold Agarose为Lanza公司产品；蛋白酶K、硫脲为AMRESCO公司产品；Gelred染液为Biotium公司产品；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3 主要仪器
SIGMA SG3K15低温离心机、ABSON Htdot50干式恒温仪、BIO-RAD icycler Thermal cycler PCR扩增仪、QIAGEN QIAxcel毛细管电泳分析仪、bioMérieux Vitek colorimeter比浊仪、Galanz微波炉、Julabo水浴摇床、Heto SBD50水浴箱、BIO-RAD CAEF-DR Ⅲ system脉冲场凝胶电泳仪、Cooling Module冷凝仪、BIO-RAD凝胶成像仪。
1.4 菌株分离鉴定
将新鲜腹泻患者粪便标本接种麦康凯培养基，37 ℃培养18～24 h，挑选可疑菌落按文献方法进行致泻性大肠埃希菌多重PCR鉴定[3]。eaeA基因扩增阳性的菌落接种新的LB培养基37 ℃培养18～24 h，细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，进一步用eaeA基因单重聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)进行复核(引物见表1)，同时用20E生化鉴定条进行系统生化鉴定。具有eaeA基因且生化鉴定为大肠埃希菌的判断为EPEC。
表1 eaeA、bfpA基因检测引物
Table 1 Primer used in eaeA and bfpA genes detection
| 目的基因 | 引物名称 | 引物序列(5′~3′) | 产物大小(bp) | 退火温度(℃) |
| eaeA | eaeA-F | TCAA TGC AGT TCC GTT ATC AGT T | 482 | 58 |
| eaeA-R | GTA AAG TCC GTT ACC CCA ACC TG | |||
| bfpA | bfpA-F | AAT GGT GCT TGC GCT TGC TGC | 324 | 58 |
| bfpA-R | GCC GCT TTA TCC AAC CTG GTA |
1.5 血清凝集
采用针对EPEC常见O血清群的12种商品化诊断OK抗血清(O26 ∶ K60、O44 ∶ K74、O55 ∶ K59、O86 ∶ K61、O111 ∶ K58、O114 ∶ K90、O119 ∶ K69、O125 ∶ K70、O126 ∶ K71、O127a ∶ K63、O128 ∶ K67、O142 ∶ K86)，按照说明书进行操作和结果判读。
1.6 典型EPEC与非典型EPEC的鉴别
细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌的DNA作为模板，采用PCR方法扩增EAF大质粒上的bfpA基因，以区分典型EPEC与非典型EPEC[4]，bfpA基因阳性的判断为典型EPEC。bfpA基因检测的PCR引物见表1。PCR 条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，BIA-RAD的GEL DOC XR成像系统拍照。
1.7 脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)分析
EPEC菌株采用XbaⅠ限制性内切酶酶切2 h，参照PulseNet大肠埃希菌O157 ∶ H7 PFGE标准方法进行操作。电泳参数：电压梯度6 V/s，电场夹角120°，脉冲时间为6.8～35.4 s，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳时间为19 h，使最小片段距胶底端1.0～1.5 cm。
条带图谱用BIO-RAD的GEL DOC XR成像系统获取图像，利用BioNumerics分析软件，UPGMA法对每株菌的DNA指纹图谱进行聚类分析。
2 结果
2.1 菌株来源情况 20株EPEC分离自成年人腹泻患者，其中男性11例，女性9例；年龄为17～75岁，年龄中位数为37岁。4例儿童腹泻患者中，年龄均为1岁，3例为男性，1例为女性。
2.2 血清分型结果
20株成年人腹泻患者EPEC分离株采用诊断血清鉴定后，仅1株鉴定为O126血清群；4株儿童分离株中，仅1株鉴定为O26血清群。其余均不能用现有的EPEC诊断血清进行分型。
2.3 典型EPEC与非典型EPEC鉴定结果
所检测的24株EPEC菌株中，bfpA基因PCR扩增均为阴性，说明通州区成年人及儿童腹泻就诊患者EPEC分离株均为非典型EPEC。
2.4 PFGE分型情况
24株EPEC菌株除1株XbaⅠ酶切后出现降解情况外，其余23株均产生较好的酶切效果，条带清晰、分布均匀，见图1。采用BioNumerics软件对电泳条带进行聚类分析后，可见23株EPEC菌株呈高度多态性，共产生21种PFGE带型。除菌株16与20、菌株9和15分别具有相同的PFGE带型外，其余菌株均为独特的带型。78%(18/23)的菌株间PFGE带型相似性<90%。相同性别及1岁年龄组EPEC分离株的PFGE带型在聚类图中虽然显示一定程度聚集性倾向，但其相似性均较小。此外，1岁儿童患者的EPEC分离株PFGE带型与成年患者分离株的PFGE带型混合存在，而并非明显的单独成簇存在(图1)。
图1 23株EPEC分离株PFGE分型结果
Figure 1 PFGE pattern of 23 EPEC isolates
3 讨论
EPEC不产生肠毒素及其他外毒素，无侵袭力。细菌在十二指肠、空肠和回肠上段黏膜表面大量繁殖，粘附于微绒毛，导致刷状缘被破坏、微绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱和功能受损，从而造成腹泻[2]。EPEC具有LEE(locus of enterocyte effacement)毒力岛，LEE编码的蛋白可介导细菌紧密地粘附于宿主上皮细胞上，激活宿主上皮细胞的信号传导途径，被感染的上皮细胞的细胞骨架发生重排，肌动蛋白积聚并在细菌粘附处形成致密的蛋白垫。宿主上皮细胞膜杯状内陷包绕细菌，细胞的刷状缘脱落并失去微绒毛，这种典型的病理损伤过程被称为A/E损伤(attaching and effacing lesions)[1]。因此通过分子生物学方法检测相关的毒力因子如eaeA目前被广泛用于鉴定EPEC 。而既往的研究认为，EPEC具有某些优势的血清群/血清型，并一度作为诊断EPEC的依据[2]。我国的《感染性腹泻诊断标准》也列举EPEC应符合O20、O26、O44、O55、O86、O111、O114、O119、O125、O126、O127、O128、O142、O158这些血清群[7]，这一依赖血清群判断EPEC的方法目前在我国仍被广泛采用。我们对经毒力基因检测方法鉴定为EPEC的24株菌进行血清群分析后，发现只有2株菌属于上述诊断标准中的血清群。这一研究结果反映了EPEC的优势血清群可能发生了变化，或者有更多血清群种类的EPEC菌株存在，因此，单纯通过血清群来诊断EPEC的方法，会造成极大的漏诊。
EPEC对HEp-2细胞表现为局灶性粘附，与存在粘附性因子的大质粒EAF(EPEC adherence factor)编码的束状菌毛Bfp相关，它可介导细菌对宿主肠道细胞的早期粘附[1]。典型EPEC含有毒力质粒EAF，而非典型EPEC含有LEE但不含毒力质粒EAF，通过检测eaeA及bfpA基因，可以区分典型EPEC和非典型EPEC[8]。先前的研究资料表明，在经济条件落后的发展中国家，典型EPEC与腹泻密切相关[9]，而发达国家以非典型EPEC为主[10]。典型EPEC的宿主主要是人，而非典型EPEC的宿主是人和动物，并可引起食源性和水源性感染暴发[11]。本研究中分离自1岁儿童和成人的EPEC菌株均为非典型EPEC，反映近年通州地区人群的EPEC可能与传统认识发生了变化。印度学者最近的研究也表明，分离自腹泻儿童的EPEC也主要(占75%，12/16)是非典型EPEC[6]。此外，虽然EAF质粒在不同来源的EPEC菌株具有较好的保守性[12]，但是通过志愿者实验研究表明，EAF质粒也具有很高的丢失率(占67%)[13]，这种高自发的质粒丢失率可能在菌株分离过程中影响对典型与非典型EPEC的判断。我们将在后续的研究中，进一步增大样本量，通过采用针对eaeA和bfpA的PCR方法对粪便标本直接扩增与增菌后扩增进行比较，结合细菌分离培养，了解在菌株分离过程中有无EAF质粒丢失情况，从而进一步明确典型EPEC与非典型EPEC的分布特征。
既往的研究资料认为，EPEC是发展中国家儿童，尤其是1岁以下儿童腹泻的重要病原菌，且主要是典型EPEC[2]。与典型EPEC不同，非典型EPEC存在于更广泛的动物宿主，是发达国家中主要存在的致泻性大肠埃希菌，近年来发展中国家如印度、巴西等也有大量从腹泻患者分离到非典型EPEC的报道 ，但非典型EPEC在我国的流行病学和致病性情况目前尚无系统研究。虽然本研究中的24株非典型EPEC菌株均分离自腹泻患者，但PFGE分析显示菌株呈高度的多态性，其在腹泻致病中的作用包括是否存在合并其他病原感染等仍需要进一步研究。
参考文献
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