1. Nanjing Center for Disease Control and Prevention, Nanjing 210003, Jiangsu China;
2. Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Etiological surveillance of bacillary dysentery in Nanjing, Jiangsu, 2007-2011
CHENG Ting-ting1, WANG Jian-ping2, SHI Xiao-chao1, YONG Wei1, DING Jie1, JIN Dong2, YU Bo2, XIE Guo-xiang1
Abstract
Objective To understand the serotype, drug resistance, carriage of virulence genes and PFGE patterns of Shigella in Nanjing from 2007 to 2011and provide evidence for the prevention and control of bacillary dysentery. Methods Totally 75 Shigella strains were isolated from hospitals in Nanjing to conduct serotyping, drug resistance test, virulence gene detection and PFGE. Results Of the 75 Shigella strains, 54 (72.0%) were identified as S. sonnei and 21 (28.0%) as S. flexneri. Shigella sonnei was predominant during this period except 2010, when S. flexneri serotype X was predominant, and All the strains isolated were resistant to ampicillin, achromycin and sulfamethylisoxazole and the resistance rate ranged from 61.1% to 95.2%. Up to 88.0% of the resistant strains were multiple drug resistant. The carriage rates of virulence genes ipaH, sen, set1 and ial were 100%, 46.7%, 24.0% and 48.0%, respectively. Virulence gene type Ⅰ was predominant in S. flexneri strains (66.7%), and type Ⅶ (61.1%) and Ⅳ (25.9%) in S. sonnei strains. All the S. sonnei strains had 20 PFGE patterns, the patterns S7, S8 and S10 (53.7%) were predominant, which shared similarity of above 95%. All the S. flexneri strains had 17 PFGE patterns. Conclusion The serotype of Shigella changed constantly in Nanjing, there is a trend of S. flexneri to be predominant circulating strain instead of S. sonnei. The multidrug resistance of Shigella strains is very serious. Virulence gene type I was predominant in S. flexneri strains and type Ⅶ and Ⅳ in S. sonnei strains.
2007-2011年江苏省南京市细菌性痢疾病原学监测结果分析
程婷婷1, 王建平2, 史小超1, 雍玮1, 丁洁1, 金东2, 余波2, 谢国祥1
1. 南京市疾病预防控制中心, 江苏 南京 210003;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 北京 昌平 102206
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 北京 昌平 102206
摘要
目的 对江苏省南京市2007-2011年细菌性痢疾的血清群(型)分布、耐药谱、毒力基因携带情况及脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析,为江苏省南京市细菌性痢疾的防控提供依据。 方法 对从江苏省南京市2007-2011年各医院腹泻病患者中分离的75株志贺菌进行血清群(型)、耐药性和毒力基因检测,并进行PFGE分子分型。 结果 75株志贺菌包括宋内志贺菌54株(72.0%),福氏志贺菌21株(28.0%),除2010年福氏X型为优势血清型外,其余年份宋内志贺菌为优势血清群;75株菌普遍对氨苄西林、四环素和磺胺甲恶唑耐药,耐药率在61.1%~95.2%之间;三重及以上耐药菌株占所有测试菌株的88.0%;毒力基因ipaH、sen、set1、ial阳性率分别为100%、46.7%、24.0%、48.0%;福氏志贺菌优势毒力基因模式为Ⅰ型(66.7%),宋内志贺菌优势基因模式为Ⅶ型(61.1%)和Ⅳ型(25.9%);宋内志贺菌分为20个PFGE基因型,其中以S7、S8、S10三个带型为主,占宋内志贺菌的 53.7%;相似度>95%,可能来自于同一克隆系;福氏志贺菌分为17种带型,各带型较散在分布。 结论 江苏省南京市志贺菌流行菌群不断变迁,宋内志贺菌有取代福氏志贺菌成为流行菌群的趋势;多重耐药现象严重;福氏志贺菌优势毒力基因模式为Ⅰ型、宋内志贺菌为Ⅶ型和Ⅳ型;PFGE型别呈现多元化流行特点。
内容大纲
1 材料与方法
1.1 菌株来源 试验菌株为2007-2011年从南京市各医院肠道门诊上送腹泻病患者粪便样本分离的志贺菌，共75株，其中宋内志贺菌54株，福氏志贺菌21株。所有菌株都进行了血清学鉴定和系统生化鉴定。参考菌株沙门菌 H9812、大肠埃希菌ATCC25922分别由中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所、江苏省CDC馈赠。
1.2 主要试剂
HE、营养琼脂等购自北京陆桥。药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司。毒力基因ipaH、sen、set1、ial 检测引物参考文献设计[2]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。蛋白酶K购自美国AMRESCO公司。十二烷基肌氨酸钠购自美国SIGMA公司。Taq DNA 聚合酶、缓冲液buffer、dNTPmix、1000 bp DNA Marker、限制性内切酶NotⅠ、XbaⅠ均购自宝生物工程(大连)有限公司、SeaKem Gold 琼脂糖购自瑞士LONZA公司。
1.3 仪器设备
PCR仪为MyCycler(Bio-rad Thermal Cycler)。浊度仪为Densimat(BioMerieux Vitek France)。脉冲场凝胶电泳仪为CHEF-DR Ⅲ system (美国Bio-Rad)；凝胶成像系统为GEL Doc 2000(美国Bio-Rad)；图谱分析软件为BioNumerics Version 5.1。
1.4 血清分型
志贺菌诊断血清购自日本生研。采用玻片凝集法，将血清滴加在洁净玻片上，以接种环挑取单菌落放在血清液滴近旁，磨匀，混入血清内制成均匀悬液，出现肉眼可见明显凝集为阳性。凝集的菌落再以0.85％的生理盐水作为对照。
1.5 毒力基因检测
选择ipaH、set1、sen、ial 4个基因，用普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)进行扩增检测。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列ipaH(F: 5′－TGG AAA AAC TCA GTG CCT CT－3′，R: 5′－CCA GTC CGT AAA TTC ATT CT－3′,423 bp)；set1 (F: 5′－TCA CGC TAC CAT CAA AGA－3′，R: 5′－TAT CCC CCT TTG GTG GTA－3′, 309 bp)；sen (F: 5′－ATG TGC CTG CTA TTA TTT AT－3′；R: 5′－CAT AAT AAT AAG CGG TCA GC－3′, 799 bp)；ial (F: 5′－CTG GAT GGT ATG GTG AGG－3′，R: 5′－GGA GGC CAA CAA TTA TTT CC－3′, 320 bp)。接种单个菌落于普通营养琼脂平板，37 ℃过夜培养，挑取适量纯菌到50 μl 无菌去离子水中，振荡混匀，沸水中煮10 min，离心收集上清作为模板。PCR反应体积为20 μl，其中10×buffer 2 μl，dNTPmix 1.6 μl， 5 U/μl Taq DNA聚合酶0.2 μl，引物1 μl (10 μmol/L)，DNA模板1 μl，去离子水13.2 μl。ipaH、set1、sen 基因反应条件: 94 ℃ 5 min预变性， 94 ℃ 45 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s、25个循环，72 ℃ 延伸5 min。ial 基因反应条件:94 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、25个循环，72 ℃延伸5 min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，以1000 bp DNA Marker 作参照，用Gelred染色观察结果。
1.6 药敏试验
志贺菌的药敏试验应用K-B纸片法[3]。以大肠埃希菌ATCC25922进行质控。
1.7 脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE)
参考美国CDC PulseNet方法制备PFGE胶块[4]。福氏志贺菌用NotⅠ酶切，宋内志贺菌与参考菌株沙门菌H9812用XbaⅠ酶切。电泳条件：福氏志贺菌初始脉冲5 s、终末脉冲35 s、120°夹角、电泳时间19 h。宋内志贺菌为初始脉冲2.2 s、终末脉冲54.2 s、120°夹角、电泳时间19 h。把胶放入l μg/mL EB液中染色30 min。置纯水中静置脱色90 min，在凝胶成像仪中读取图像。PFGE图像应用BioNumerics数据库软件进行处理，识别图像条带。选择UPGMA方法进行聚类分析。
2 结果
2.1 血清型特征 2007-2011年，江苏省南京市共分离到志贺菌75株。用志贺菌诊断血清确认、分型，其中54株为宋内志贺菌，21株为福氏志贺菌。福氏志贺菌主要为1a(1株)，2a(5株)，X(6株)，XV(5株)，1b(4株)5个血清型。未见鲍氏及痢疾志贺菌，见表1。
2.2 抗生素耐药情况
对75株分离菌株进行耐药分析。结果显示，福氏志贺菌对氨苄西林、四环素、萘啶酸、磺胺甲恶唑耐药率较高，分别为95.24%、90.48%、76.19%和61.90%，而对头孢噻肟、庆大霉素、阿莫西林、诺氟沙星、头孢噻吩较为敏
表1 2007-2011年江苏省南京市分离志贺菌株血清群、型情况(1)
Table 1 Serogroup and serotype of Shigella isolated in Nanjing, 2007-2011
| 年份 | 宋内志贺菌 | 福氏志贺菌 | 合计 | |||||||||||||||||
| 1a | 2a | 1b | XV | X | ||||||||||||||||
| 株数 | 构成比(%) | 株数 | 构成比(%) | 株数 | 构成比(%) | 株数 | 构成比(%) | 株数 | 构成比(%) | 株数 | 构成比(%) | 株数 | 构成比(%) | |||||||
| 2007 | 12 | 80.00 | 1 | 6.67 | 0 | 0.00 | 0 | 0.00 | 2 | 13.33 | 0 | 0.00 | 15 | 100.00 | ||||||
| 2008 | 7 | 63.64 | 0 | 0.00 | 1 | 9.09 | 0 | 0.00 | 3 | 27.27 | 0 | 0.00 | 11 | 100.00 | ||||||
| 2010 | 1 | 12.50 | 0 | 0.00 | 2 | 25.00 | 1 | 12.50 | 0 | 0.00 | 4 | 50.00 | 8 | 100.00 | ||||||
| 2011 | 34 | 82.93 | 0 | 0.00 | 2 | 4.88 | 3 | 7.32 | 0 | 0.00 | 2 | 4.88 | 41 | 100.00 | ||||||
感。宋内志贺菌对氨苄西林、四环素、磺胺甲恶唑、庆大霉素耐药率较高，分别为88.89%、70.37%、61.11%和59.26%；对头孢噻肟、萘啶酸、诺氟沙星、头孢噻吩较为敏感。宋内志贺菌对阿莫西林均敏感，见表2。所有菌株三重及以上耐药菌株占所有测试菌株的88.00%，其中福氏志贺菌25.34%，宋内志贺菌62.66%，且以耐3~5种抗菌药物的菌株居多，占82.63%。
表2 2007-2011年江苏省南京市志贺菌分离株耐药率
Table 2 Drug resistant rate of Shigella isolated in Nanjing, 2007-2011
| 药物名称 | 福氏志贺菌 | 宋内志贺菌 | |||
| 耐药菌株数 | 耐药率(%) | 耐药菌株数 | 耐药率(%) | ||
| 氨苄西林 | 20 | 95.24 | 48 | 88.89 | |
| 阿莫西林 | 3 | 14.29 | 0 | 0.00 | |
| 头孢噻吩 | 6 | 28.57 | 20 | 37.04 | |
| 头孢噻肟 | 2 | 9.52 | 2 | 3.70 | |
| 庆大霉素 | 2 | 9.52 | 32 | 59.26 | |
| 萘啶酸 | 16 | 76.19 | 12 | 22.22 | |
| 诺氟沙星 | 4 | 19.05 | 18 | 33.33 | |
| 磺胺甲恶唑 | 13 | 61.90 | 33 | 61.11 | |
| 四环素 | 19 | 90.48 | 38 | 70.37 | |
2.3 毒力基因携带情况
所有菌株均检测到ipaH基因。按毒力基因分布特征75株菌可形成7种基因模式，其中福氏志贺菌以Ⅰ型模式为主，占68.18%；宋内志贺菌以Ⅶ型模式为主，占60.38%，其次为Ⅳ型模式，占26.42%，见表3、4。
表3 毒力基因分布情况
Table 3 Virulence gene distribution of Shigella isolated
| 毒力基因 | 福氏(n=21) | 宋内 (n=54) |
合计 | |
| 菌株数 | 构成比(%) | |||
| ipaH | 21 | 54 | 75 | 100.00 |
| Sen | 18 | 17 | 35 | 46.67 |
| Set1 | 18 | 0 | 18 | 24.00 |
| ial | 18 | 18 | 36 | 48.00 |
表4 毒力基因模式
Table 4 Type of virulence gene
| 型别 | 毒力基因 | 福氏 | 宋内 | |||
| 菌株数 | 构成比(%) | 菌株数 | 构成比(%) | |||
| Ⅰ | ipaH+ sen+ set1+ ial+ | 14 | 66.67 | 0 | 0.00 | |
| Ⅱ | ipaH+ set1+ ial+ | 1 | 4.76 | 0 | 0.00 | |
| Ⅲ | ipaH+ set1+ | 2 | 9.52 | 0 | 0.00 | |
| Ⅳ | ipaH+ sen +ial+ | 2 | 9.52 | 14 | 25.93 | |
| Ⅴ | ipaH+ sen+ | 1 | 4.76 | 3 | 5.56 | |
| Ⅵ | ipaH+ ial+ | 0 | 0.00 | 4 | 7.41 | |
| Ⅶ | ipaH+ | 1 | 4.76 | 33 | 61.11 | |
2.4 PFGE结果
21株福氏志贺菌PFGE带型相似性系数在52.00%~98.00%之间，共分为17种带型(F1~F17)。其中F5型4株，均为X血清型；F15型2株，均为1b血清型；其余带型均为一株。各带型分布较散在，见图1。
54株宋内志贺菌PFGE带型相似性系数在74.00%~98.00%之间，共分为20种带型(S1~S20)。其中S8型21株，占测试菌株的38.89%；S1
图1 21株福氏志贺菌PFGE带型聚类图
Figure 1 PFGE pattern of 21 S. flexneri strains
型4株(7.41%)，S4型2株(3.70%)， S7型4株(7.41%)，S10型4株(7.41%)，S12型3株(5.56%)，S20型3株(5.56%)，其余带型均为一株。S7、S8、S10的相似度>95%，共29株，占所有检测菌株的 53.70%，因此S7、S8、S10为南京市分离宋内志贺菌的主要带型，见图2。
图2 54株宋内志贺菌PFGE带型聚类图
Figure 2 PFGE pattern of 54 S. sonnei strains
3 讨论
本研究发现，南京市2007-2011年细菌性痢疾以宋内志贺菌和福氏志贺菌感染为主，福氏志贺菌主要血清型是X、2a和XV。志贺菌各菌群和菌型的分布与变迁是随着国家、地区和年代的不同而异，在欧美发达国家，细菌性痢疾主要由宋内志贺菌引起，而在发展中国家以福氏志贺菌为主 。在我国，不同地区优势血清群(型)也不尽相同，多数地区一直是福氏志贺菌为主要流行菌群，又以2a亚型多见，近年来有些地区流行血清群、型有所变化，其中宋内志贺菌有上升趋势，也有多起由宋内志贺菌引起暴发的报道 。根据本次研究结果，南京市2007年和2008年优势血清群为宋内志贺菌；2010年福氏X型占优势；2011年宋内志贺菌又重新成为优势群。提示随着国民经济、医疗卫生事业的发展，南京市志贺菌的菌群正在发生转变，逐渐以宋内志贺菌占优势。人体对志贺菌感染的免疫保护是血清型特异的，因此血清型变迁对志贺菌的流行有重要意义，应针对该菌实施动态监测，并加强优势群、型生物学特性研究。
目前临床治疗细菌性痢疾主要还是靠抗菌药物，但随着耐药菌的增加，耐药现象越来越重。志贺菌耐药性增加已引起全球广泛关注，国内外进行了大量耐药性检测和研究，结果表明，其对多种抗菌药物都产生耐药性 。本次研究显示，宋内志贺菌和福氏志贺菌普遍对氨苄西林、四环素和磺胺甲恶唑耐药；宋内志贺菌对阿莫西林均敏感，对头孢噻肟较敏感(耐药率为3.70%)；福氏志贺菌对庆大霉素和头孢噻肟较敏感。说明不同血清群对不同抗菌药物敏感性有一定差异，提示对于痢疾患者的治疗，应先进行分离培养、血清分型和药物敏感性试验，从而有针对性的使用抗生素。南京市志贺菌耐药现象已十分普遍，多重耐药现象严重，其中宋内志贺菌尤为突出，应引起有关部门高度重视，深入开展其耐药机制及相关研究。
本文还检测与志贺菌肠毒素或侵袭力相关的4种毒力基因。ipaH基因存在于染色体和质粒上，通常作为志贺菌属的鉴定基因 ，本次所有检测菌株均携带ipaH基因，阳性率100%，表明所分离的菌株符合其血清学特征。Set1基因编码志贺菌肠毒素1，导致腹泻，所检测菌株中福氏志贺菌中携带率为85.71%，且该基因分布于福氏各血清型，但宋内志贺菌均未检测到。Sen基因编码志贺菌肠毒素2，ial基因具有肠细胞粘附能力，所检测志贺菌中sen基因阳性率为46.67%，ial基因阳性率为48.00%，与国外报道有所差异[13]，这可能与菌株来源于不同国家和地区相关，由菌株遗传背景差异引起。按毒力基因分布特征模式，南京市福氏志贺菌与宋内志贺菌存在明显不同，福氏志贺菌以Ⅰ型模式为主(68.18%)，宋内志贺菌以Ⅶ型模式为主(60.38%)、其次为Ⅳ型模式(26.42%)，这种差异可能同菌群变迁存在一定关联，同时也提示上述几种毒力基因模式为南京市志贺菌优势基因流行模式。
PFGE分型结果在一定程度上说明南京市志贺菌的变异度比较大且呈现多样性。所有宋内志贺菌分为20个PFGE基因型，其中以S7、S8、S10这三个带型为主，占所有检测菌株的 53.70%，相似度>95%，推测可能来自于同一克隆系。所有福氏志贺菌分为17种带型，各带型分布较散在。其中F5型4株，均为X血清型；F15型2株，均为1b血清型；其余带型各一株。这可以进一步证实既往研究的发现，福氏志贺菌基因组是相对保守的，不同血清型间通过血清型转换噬菌体的整合进行血清型转换[14]。
本次研究，初步掌握了南京市志贺菌菌群(型)的分布、耐药谱、毒力基因携带情况和PFGE分子分型的特点，为该市制定适宜的防控对策、指导细菌性痢疾临床合理用药提供了科学依据。
参考文献
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