疾病监测, 2013, 28(5): 360-361
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.5.008
Impact of co-infection of hepatitis C virus and Mycobacterium tuberculosis on patient’s natural killer cell
CHEN Jian-ping1, XU Wen-fang2
Department of Clinical Laboratory, the 3rd People Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310009, Zhejiang, China
Abstract
Objective To study the impact of co-infection of hepatitis C virus and Mycobacterium tuberculosis on patient's natural killer (NK) cells and explore the immunological function of NK in the patients co-infected with hepatitis C virus and M. tuberculosis. Methods Totally 47 patients with simple hepatitis C infection, 66 patients with simple infection of M. tuberculosis and 27 patients co-infected with hepatitis C virus and M. tuberculosis were selected. The NK cell counts and secreted cytokines contains in theirs peripheral blood were detected with flow cytometry (FCM). Results The NK cell counts and IFN-γ contains in peripheral blood of the patients co-infected with hepatitis C virus and M. tuberculosis were obviously lower than those of the patients with simple hepatitis C infection or simple M. tuberculosis infection,the differences were statistical significant (P<0.05). Conclusion The co-infection reduced the NK cell counts and activity in peripheral blood. Cellular immunity was involved in the development and progress of co-infection of hepatitis C virus and M. tuberculosis, which should be considered in clinical diagnosis and treatment.
Keywords:    hepatitis C virus   Mycobacterium tuberculosis   co-infection   NK cell  

丙型病毒性肝炎病毒重叠结核杆菌感染患者的自然杀伤性细胞的分析
陈建萍1, 许文芳2
1. 杭州市第三人民医院检验科, 浙江 杭州 310009;
2. 绍兴市第六人民医院检验科
摘要
目的 研究丙型病毒性肝炎(丙肝)重叠结核杆菌感染对NK细胞的作用,探讨NK细胞在丙肝重叠结核杆菌感染患者体内的免疫学功能。 方法 选择单纯丙肝感染患者47例,单纯结核杆菌感染患者66例,丙肝重叠结核杆菌感染患者27例,应用流式细胞仪检测患者外周血中NK细胞的数量及分泌的细胞因子的含量。 结果 丙肝重叠结核杆菌感染患者的NK细胞数量明显低于单纯感染组,二者比较差异有统计学意义(P<0.05),IFN-γ的含量亦明显低于单纯感染组,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 重叠感染组的NK细胞数量及活性下降,细胞免疫机制参与了丙肝重叠结核杆菌感染的发病及发展。
关键词:    丙型病毒性肝炎病毒   结核杆菌   重叠感染   NK细胞  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 临床标本
1.2 检测方法
1.2.1 标本采集、试剂及仪器
1.2.2 CD+3、CD+4、CD+8和CD+16/CD+56的检测
1.2.3 NK细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α检测
1.3 NK细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α检测
2 结果
2.1 三组间淋巴细胞亚群表达水平的情况
2.2 三组治疗前NK细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α表达情况
3 讨论
　　NK细胞具有抗感染、免疫调节功能，是主要的固有免疫细胞群，NK细胞分泌的IFN-γ和TNF-α细胞因子在免疫反应中具有十分重要的意义[1]。丙型病毒性肝炎(hepatitis C，丙肝)是由丙肝病毒感染引起的以肝脏损害为主的一种全身性传染病,NK细胞在抵御病毒的入侵、抑制病毒的复制以及免疫介导方面发挥重要作用。而细胞免疫与结核病之间的关系非常复杂，与结核病的发生、发展及转归有关。本文分析重叠感染与单纯感染患者NK细胞数量及分泌IFN-γ和TNF-α的功能情况，以了解机体免疫状态、免疫功能紊乱情况，并对检测项目之间的相互关系进行分析，探讨NK细胞在发病过程中的作用，为可能的免疫治疗提供新的思路和理论依据。
1 材料与方法
1.1 临床标本
　　 2008年5月至2012年3月绍兴市第六人民医院住院的单纯结核杆菌感染患者66例，单纯丙肝感染者47例，重叠感染者27例。诊断标准均参照中华医学会结核病分会制定的《结核病诊断和治疗指南》及2004年《丙型肝炎防治指南》诊断标准，所有病例均无免疫药物治疗史，其中单纯结核杆菌感染者男性43例，女性23例，平均年龄(36.6±13.4)岁；单纯丙肝病毒感染者组男性31例，女性16例,平均年龄(35.4±12.8)岁；重叠感染者男性17例,女性10例, 平均年龄(38.3±10.6)岁；三组间年龄性别差异均无统计学意义(P>0.05)。
1.2 检测方法
1.2.1 标本采集、试剂及仪器
　　标本用肝素钠抗凝外周血5 ml分离出外周血淋巴细胞(PBMC)备用，流式细胞仪器为贝克曼库尔特Epics XL.MCL，试剂为配套试剂。
1.2.2 CD+3、CD+4、CD+8和CD+16/CD+56的检测
　　 取流式专用试管2支，1支加入10 μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD+3、CD+4、CD+8鼠抗人单克隆抗体,1支加入10 μl藻红蛋白(PE)标记的 CD+16/CD+56单克隆抗体,分别加入全血60 μl，混匀后室温避光15 min，在Q-PREP溶血仪上溶血,室温固定15 min后，置流式细胞仪上测定。其得到的百分率通过外周淋巴细胞数计算绝对值。
1.2.3 NK细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α检测
　　收集PBMC，调整PBMC密度至6×106悬浮于1 ml的PRMI 1640培养基(含10%胎牛血清，100 IU/ml青霉素和0.1 ng/ml链霉素)，加入20 μl巴豆酯(PMA)、1.3 μl离子霉素,置CO2培养箱中培养1 h,然后加入细胞因子阻断剂，继续孵育6 h。收集全血细胞,分别加入PE标记的CD+56抗体及FITC标志的CD+3抗体，避光20 min后，加入FIX(固定剂)和perm(破膜剂)，混匀，避光5 min,然后加入PE抗人IFN-γ和FITC抗人TNF-α及同型对照,30 min后上流式细胞仪检测。
1.3 统计学分析
　　采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料比较采用t检验，设P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组间淋巴细胞亚群表达水平的情况
　　重叠感染组与单纯结核感染组、单纯丙肝感染组相比较，其CD+8绝对值高于单纯感染组，差异有统计学意义(t值分别为2.23、 2.41，P<0.05)；CD+16/CD+56绝对值低于单纯感染组，差异有统计学意义(t值分别为2.32，2.05，P<0.05)，结果见表1。

表1 单纯感染与重叠感染患者的外周血淋巴细胞的表达水平
Table 1 Expression of lymphocyte in peripheral blood in simple infection groups and co-infection group (×109/L)
组 别CD+3CD+4CD+8CD+16/CD+56
单纯结核感染组1.13±0.590.44±0.220.58±0.370.16±0.10
单纯丙肝病毒感染组1.11±0.540.46±0.290.56±0.400.14±0.11
重叠感染组1.10±0.510.47±0.330.64±0.450.10±0.06


2.2  三组治疗前NK细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α表达情况
　　重叠感染组与单纯结核感染组、单纯丙肝感染组相比较，其IFN-γ值降低，差异有统计学意义(t值分别为2.98、3.11，P<0.05)，但TNF-α值比较差异无统计学意义，结果见表2。
3 讨论
　　机体细胞免疫功能正常发挥的重要基础是T淋巴细胞的数量 及各亚群间比例相对稳定，CD+3(总

表2 三组治疗前 IFN-γ、TNF-α分泌水平的情况
Table 2 IFN-γ and TNF-α secretion in three groups before treatment (pmol/L)
组 别IFN-γTNF-α
单纯结核感染组治疗前13.66±7.2228.25±14.9
单纯丙肝病毒感染组治疗前14.92±10.4726.70±13.6
重叠感染组治疗前10.35±10.5225.60±12.3


T细胞)和CD+4(辅助性T细胞)在感染丙肝病毒后，启动迟发性超敏反应，引起肝细胞的损伤，在 抗结核免疫中不直接参与抗原识别，但可通过信号转导作用激活T淋巴细胞启动细胞免疫；CD+8(细胞毒性T细胞)直接攻击HCV感染的肝细胞和识别结核杆菌胞质抗原进而攻击靶细胞。我们对T细胞亚群测定表明重叠感染组CD+8T淋巴细胞高于单纯感染组，可能为重叠感染后T淋巴细胞再次被激活，产生毒性T淋巴细胞，从而导致CD+4/CD+8的比例偏低，可见患者在丙肝合并结核杆菌感染时总体细胞免疫功能比单纯感染有所降低。
在人外周血NK细胞中，主要是CD+16/CD+56(90%)细胞，释放一些细胞因子(IFN-γ、TNF-α等)来调节免疫功能。IFN-γ是单核巨噬细胞的强激活剂，可促使巨噬细胞产生抗菌分子，发挥杀灭胞内结核菌的作用 。IFN-γ亦是人体免疫系统抵抗病毒感染的主要细胞因子之一，还具有抗肝纤维化的作用。本研究显示，重叠感染组的CD+16/CD+56细胞绝对值减少，NK细胞数量下降，机体细胞免疫进一步失衡；IFN-γ分泌水平下降，NK细胞的活性下降，对病原菌的杀灭、清除作用减弱，导致丙肝病毒、结核菌在靶细胞内持续复制，免疫调节功能低下。 结果亦显示，重叠感染组与单纯感染组的TNF-α的分泌水平无差异，可能是机体感染丙肝病毒或/和结核菌杆菌后，机体免疫系统活化，导致或促进单核细胞亦合成和释放TNF-α，另外，丙肝病毒及结核杆菌产生的内毒素及免疫复合物亦可促进机体分泌大量的TNF-α，所以重叠感染时TNF-α可以由多种细胞分泌，不能简单的反应NK细胞的活性。因此，IFN-γ的测定对重叠感染患者的免疫状态的了解有重要意义。

参考文献
[1] Martin-Fontecha A,Thomsen LL,Brett S,et al. Induced recruitment of NK cells to lymph nodes provides IFN-gamma for T(H)1 priming[J].Nat Immunol,2004,5(12):1260-1265.
[2] Millington KA,Innes JA,Hackforth S,et al.Dynamic relationship between IFN-gamma and IL-2 profile of Mycobacterium turber-culosis-specific T cells and antigen load[J]. J Immunol,2007,178(8):5217-5226.
[3] Mansouri D,Adimi P,Mirsaeidi M,et al,Inheritde disorders of the IL-12-IFN-gamma axis in patients with disseminated BCG infection[J].Eur J Pediatr,2005,164(12):753-757.