疾病监测, 2013, 28(6): 424-428
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.6.003
Genetic diversity of VchintIA gene in super integron of O1 and O139 Vibrio cholerae isolates
LU Xin, DU Xiao-li, LIU Sha, KAN Biao, PENG Bo
State Key Laboratory for Communicable Diseases Prevention and Control, Institute for Communicable Diseasee Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract
Objective To understand the diversity of VchintIA gene of O1 and O139 V. cholerae and the relationship between the diversity of VchintIA and different lineages of V. cholerae. Methods Polymerase chain reaction, sequencing and bioinformatics analysis were conducted in this study. Results The VchintIA gene amplification was conducted for all tested strains. The sequences of VchintIA gene were identical in toxigenic O1 El Tor, toxgenic O139 and tcp-gene-cluster positive nontoxigenic O1 El Tor strains. The VchintIA gene in tcp-gene-cluster negative nontoxigenic O1 El Tor strains only showed variation at nucleotide level, however, nontoxigenic O139 strains showed the variation in both nucleotide acid level and amino acid level. Conclusion The diversity of VchintIA at both nucleotide acid le4vel and amino acid level were observed in O1 and O139 V. cholerae strains. This variation in the VchintIA of nontoxigenic O139 strains may play certain role in the structural variation of super integron in these strains.
Keywords:    Vibrio cholerae   VchintIA   super integron   diversity analysis  

O1和O139群霍乱弧菌超级整合子VchintIA基因的变异
卢昕, 杜小莉, 刘莎, 阚飙, 逄波
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206
摘要
目的 研究不同血清群(型)霍乱弧菌超级整合子整合酶基因(VchintIA)的变异及其与霍乱弧菌分类的关系。 方法 使用聚合酶链反应(PCR)和序列测定的方法对VchintIA基因进行扩增和序列分析。 结果 在实验菌株中,O1El Tor和O139群霍乱弧菌产毒株以及毒素共调菌毛(toxin co-regulated pilus, tcp)基因簇阳性的O1群非产毒株的VchintIA序列完全一致,tcp基因簇阴性的O1群非产毒株的VchintIA序列在核苷酸水平上与产毒株不同,但是在氨基酸水平上相同。O139非产毒株的VchintIA序列在核苷酸和氨基酸水平上均与产毒株的VchintIA不同。 结论 O1和O139霍乱弧菌超级整合子VchintIA存在核苷酸和氨基酸水平上的变异,O139非产毒株中VchintIA的变异与其整合子内部的结构可能相关。
关键词:    霍乱弧菌   整合酶   超级整合子   变异分析  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 菌株
1.2 菌株的鉴定以及毒力相关基因的检测
1.3 菌株的培养以及核酸提取
1.4 VchintIA基因的扩增及产物序列测定
1.5 基于实验菌株VchintIA基因序列聚类关系树的构建
2 结果
2.1 实验菌株中VchintIA基因变异分析
2.2 基于VchintIA基因核苷酸序列的实验菌株聚类关系树的构建
3 讨论
　　霍乱发生过七次世界大流行，目前全世界仍然处于由El Tor霍乱弧菌引起的第七次霍乱大流行中[1]。O139血清群霍乱弧菌在1992年突然出现后[2]，至今已引起了多次霍乱暴发流行，目前还局限于亚洲[3]。我国自1961年开始出现El Tor霍乱流行，1992年开始出现O139群霍乱弧菌引起的暴发流行[4]。50多年来，霍乱在我国的流行存在静息数年与跨年度流行相间隔的特征，因此虽然近期处于流行低发阶段，但也可能预示将来大流行的再次出现[5]。
虽然引起霍乱暴发流行的几乎都是产毒株，但在我国的监测中，由非产毒株引起的腹泻病例并不罕见[5]。在携带霍乱毒素基因的溶原性噬菌体CTX的作用下，非产毒株有可能被产毒株释放的CTX感染而转变为产毒株[6]。
整合子由Stokes和Hall[7]于1989年首次提出，它是由整合酶的编码基因(intI)、耐药基因盒以及耐药基因盒的整合位点所组成的遗传单位。而在霍乱弧菌中发现的超级整合子(super integron, SI)是一种更复杂的基因捕捉系统，含有大量的捕获基因[8]。研究提示，超级整合子可能在霍乱弧菌的适应性生存中发挥作用，而且超级整合子的微进化极大地推动了霍乱弧菌基因组的进化[9]。
我们之前的研究提示超级整合子是霍乱弧菌基因组中变异最大的区域之一，这种差异不仅存在于产毒株与非产毒株之间[10]，而且存在于产毒株内部[11]。造成这种差异的可能原因之一是超级整合子中VchintIA整合游离基因盒的能力。之前的研究虽然显示霍乱弧菌超级整合子中的整合酶VchintIA与I型整合子中的intI1在结构以及整合基因盒能力方面均有差异[12]，但是关于霍乱弧菌不同血清群(型)菌株之间VchintIA是否存在差异并没有报道。为了探索不同霍乱弧菌菌株的VchintIA之间在核苷酸以及氨基酸水平上是否有差异，我们选择了28株O1群和O139群产毒株以及非产毒株，研究其VchintIA的序列变异情况，以及这种变异与霍乱弧菌分类之间的联系。
1 材料与方法
1.1 菌株
　　实验菌株共28株，其中O1血清群20株，O139血清群8株。所有菌株均来自国家医学弧菌保存中心霍乱弧菌菌株库。实验菌株分离自1961年以来我国不同省份，且具有不同的 脉冲场凝胶电泳(PFGE)型别(表1)。
1.2 菌株的鉴定以及毒力相关基因的检测
　　所有菌株均使用弧菌鉴定生物化学反应鉴定为霍乱弧菌。使用血清学和实时荧光聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法确定菌株血清群[13],引物、探针列于表2，反应条件如下：95 ℃ 3 min; 95 ℃ 10 s, 58 ℃ 20 s(每个循环降低1 ℃)，72 ℃ 15 s，10个循环； 95 ℃ 10 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 15 s，40个循环。使用普通PCR方法确定菌株是否携带霍乱毒素A、B基因(cholera toxin A B，ctxAB)及毒素共调菌毛(toxin co-regulated pilus，tcp)基因簇[11]。

表1 实验中使用的菌株
Table 1 Strains used in the study
菌株血清群/生物型血清型分离时间分离  地点  是否携带ctxAB是否携带tcp基因簇
V0518O1, El TorOgawa2005中国否是
SD95001O1, El TorInaba1995中国否是
93097O1, El TorOgawa1993中国否是
V0550O1, El TorInaba2005中国否否
19-22O1, El TorOgawa1977中国否否
JS32O1, El TorInaba1990中国否否
7743O1, El TorOgawa1977中国否是
FJ147O1, El TorInaba2005中国是是
ZJ0596O1, El TorInaba2005中国是是
V011506O1, El TorInaba2001中国是是
200106O1, El TorInaba2001中国是是
93284O1, El TorOgawa1993中国是是
FJ80004O1, El TorInaba1980中国是是
D118O1, El TorOgawa1961中国是是
6312O1, El TorOgawa1961印度尼西亚是是
N16961O1, El TorInaba1975孟加拉是是
79005O1, El TorOgawa1979中国是是
Wujiang-2O1, El TorInaba1980中国是是
FJ0299357O1391999中国是是
93010O1391993中国是是
93209O1391993中国是是
93028O1391993中国是是
98106O1391998中国是是
200306O1392003中国是是
SCH04082O1392004中国否否
94001O1391994中国否否
569BO1, classicalInaba1948印度是是
O395O1, classicalOgawa1964印度是是


1.3 菌株的培养以及核酸提取
　　在过夜培养的碱性琼脂培养基(pH 8.4)挑选单菌落接种于5 ml的碱性(pH 8.4)Luria-Bertani(LB)肉汤中，37 ℃下250 r/min振荡培养6 h。使用Nucleo Tissue Kit(Macherey-Nagel，德国)提取细菌基因组DNA。
1.4 VchintIA基因的扩增及产物序列测定
　　使用引物VchintIA_F和VchintIA_ R对实验菌株扩增VchintIA 基因及VchintIA基因上游330 bp，下游100 bp 片段。VchintIA_F：5′-GTG GAT TGC ACG TAT CAA

表2 实时荧光PCR基因、引物和探针信息
Table 2 Gene, primer and probe used in real-time fluorescent PCR
基因、引物和探针序列(5′~3′)浓度(μmol/L)产物大小(bp)
O1 rbf
O1-F
O1-R
O1-P		CCA GAT TGT AAA GCA GGA TGG A
GGT CAT CTG AAG TAC AAC
FAM-CCC GGA GTT TGT AAG CCC ACT ACC GGG-Dabcyl		0.04
0.06
0.05
203
O139 rbf
O139-F
O139-R
O139-P		CATA CCA ACG CCC TAT CCA TT
GCA TGA CTG GCA TCC CAA AAT
Cy5-CGG GTG AGA AAA GAC AGC AAT AAC ACC CG-Dabcyl		0.02
0.02
0.05
160


CG-3′，VchintIA_R：5′-AAA GCG CCT AAC GCT TTC TA-3′。PCR条件如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物由六合通公司测定序列。
1.5 基于实验菌株VchintIA基因序列聚类关系树的构建
　　使用Mega 5.0软件根据测序结果进行比对，构建Neighbor-Joining聚类关系树。
2 结果
2.1 实验菌株中VchintIA基因变异分析
　　所有菌株的血清群、血清型、携带ctxAB基因和tcp基因簇的信息列于表1。在所有实验菌株中均得到约1.4 kb的扩增产物。对实验菌株扩增产物的序列与El Tor参考菌株N16961中的VchintIA序列，使用Mega 5.0软件进行比对，结果显示，所有实验菌株中均包含完整的VchintIA基因，且序列长度与在N16961中VchintIA长度一致，均为963 bp。在核苷酸水平上，实验菌株VchintIA基因的一致性序列包括963个核苷酸，其中949个位点为保守核苷酸位点，14个位点为可变核苷酸位点(图1)。在氨基酸水平上，实验菌株VchintIA基因编码产物的一致性序列包括321个氨基酸，其中320个位点为保守氨基酸位点，1个位点为可变氨基酸位点。与N16961中的VchintIA基因编码产物相比，发生氨基酸序列突变的菌株中第43位(94001)氨基酸分别由Ser(S)突变为Asn(N)。
2.2 基于VchintIA基因核苷酸序列的实验菌株聚类关系树的构建
　　基于VchintIA基因的全序列，使用Mega 5.0软件构建了实验菌株的聚类关系树(图2)。所有实验菌株分成了三大群体(Group1，Group2和Group3)。Group1包括24株菌株，其中O1群古典型菌株2株，O1群El Tor产毒株11株，携带tcp基因簇的O1群El Tor非产毒株4株，不携带tcp基因簇的O1群El Tor非产毒株1株，O139群产毒株6株；Group2包括2株菌株，均为不携带tcp基因簇的O1群El Tor非产毒株；Group3包括2株O139群非产毒株。

图1 实验菌株VchintIA基因核苷酸水平上的变异
Figure 1 Variation of VchintIA of tested strains at nucleotide level
实验菌株<i>VchintIA</i>基因核苷酸水平上的变异


图2 根据VchintIA基因核苷酸序列构建的菌株系统发生树
Figure 2 Phylogenetic tress of strains constructed according to nucleotide sequence of VchintIA
根据<i>VchintIA</i>基因核苷酸序列构建的菌株系统发生树

3 讨论
　　SI是一个古老的结构, 其内部的微进化一直在进行，基因的获得、丢失或者复制频繁发生。在多种含有SI的细菌的进化分析中，发现SI的进化与细菌的进化相平行[9]。已经有明确证据表明， SI内基因盒的频繁流动与细菌基因组的可塑性及异质性有关，因此SI的微进化是推动细菌基因组进化的重要力量，并且由于其内部基因盒编码与细菌适应能力相关的蛋白，因此可能赋予细菌在不同环境中适应性生存的能力。我们之前的研究提示，在O1和O139群霍乱弧菌基因组中，超级整合子是变异最为明显的区域之一[10]。而在整体基因组构成保守的O1群El Tor和O139群产毒株中，超级整合子区域也是基因组中变异最大的区域[10]。不同实验菌株中该区域的差异决定了菌株之间的差异。另外，与整体基因组稳定性形成对比的是，根据超级整合子和全基因组CGH结果绘制的聚类树之间的相似系数只有45.5％，显示巨整合子区发生了较大的变异[10]。
由于SI的主动捕获，使得SI在不同菌株中表现出差异，而执行捕获功能的基因就是存在于超级整合子内的VchintIA基因[8]。I型整合子的整合酶intI1和霍乱弧菌SI整合酶VchintIA整合和删除基因盒能力比较提示，整合酶种类和活性的强弱分别决定了相应整合子整合基因盒的种类和能力[12]。这种差异影响到整合子的结构和稳定性，并直接决定SI的微进化，进而影响霍乱弧菌基因组的进化。
在本研究中，我们发现所有实验菌株均存在完整的VchintIA基因，这或许是所有实验菌株中均存在超级整合子的结构和功能基础；而不同来源、不同血清群(型)以及谱系的霍乱弧菌菌株(古典型菌株、El Tor型菌株、携带tcp基因簇和不携带tcp基因簇的O1群El Tor非产毒株以及O139群非产毒株菌株)的VchintIA在核苷酸和氨基酸水平上则均存在差异。这些差异可能与细菌的致病力或者生存环境相关。例如，所有的产毒菌株，无论是O1群还是O139群都具有相同的VchintIA，而分离自外环境水体中的两株O139非产毒株中的VchintIA则均与前者不同。根据VchintIA基因构建的实验菌株聚类关系树(图2)与根据CGH构建的菌株聚类关系树有较高的一致性[10]。值得注意的是，在根据VchintIA基因构建的菌株聚类关系树中，O1群古典型菌株、O1群El Tor产毒株、携带tcp基因簇的O1群El Tor非产毒株聚集在一起，该结果与基于全基因组序列的研究结果一致[14]，即在O1群霍乱弧菌非产毒株中存在至少两个谱系，携带tcp基因簇的谱系与不携带tcp基因簇的谱系，携带tcp基因簇的谱系与产毒株的遗传关系更为接近。值得注意的是，尽管O1群非产毒株中的VchintIA在核苷酸水平上与产毒株存在变异，但是在氨基酸水平上并没有差异，这或许能够部分解释这些非产毒株中超级整合子虽然存在结构变异，但是变异程度相对较小。与此相反，O139非产毒株中的VchintIA在氨基酸水平上与产毒株存在变异，而且该突变为非同义突变。提示这些基因编码的产物在功能上可能存在差异，而这种差异所导致的整合酶整合能力的差异或许在霍乱弧菌超级整合子结构差异中发挥重要作用，进而影响霍乱弧菌在不同环境下的适应以及生存能力。这与我们观察到的O139非产毒株中超级整合子结构变异巨大相一致。不同VchintIA编码产物功能差异研究则能为该推论提供支持或者反对的证据。
在本研究中，我们比较了O1群和O139霍乱弧菌菌株中VchintIA的差异，这既能够解释O1群和O139群产毒株之间SI区域异常保守的现象，又能够解释O139非产毒株之间SI变异明显的现象。此外，该研究还发现，在O1群非产毒株中，VchintIA至少存在两种序列，而这两种与基因组水平上的菌株分类相一致，说明SI区域在霍乱弧菌整体基因组的进化中发挥重要的作用。因此，本研究不但为霍乱弧菌超级整合子的研究提供基础性资料，同时也为研究超级整合子对于霍乱弧菌自然环境中的保存维持和在宿主(人)小肠环境中几何级数的迅速繁殖的双生态生存中可能发挥的作用提供线索。这些研究产生的成果能够促进我们对霍乱弧菌自然进化、不同菌型霍乱弧菌的环境适应/宿主适应与致病能力差异的理解。

参考文献
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