疾病监测, 2013, 28(6): 438-441
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.6.006
Carriage rate of Neisseria meningitidis among healthy population with bacterium culturing and real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction
WANG Ying-tong1,2, SUN Yin-qi1, JIA Zhao-yi1, HE Bao-hua1, JIANG Xia1, ZHU Bing-qing2, SHAO Zhu-jun2
1. Hebei Provincial Centre for Disease Control and Prevention Shijiazhuang 050021 Hebei, China;
2. Institute for Communicable Disease Prevention and Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract
Objective To understand the carrying status of Neisseria meningitidis among healthy people in selected areas of Hebei province, and evaluate the performance of real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) in N. meningitidis carriage detection as the supplement to conventional culturing. Methods Throat swabs were taken from 577 healthy people selected by stratified cluster random sampling based on age, and the isolation of N.meningitidis was conducted with both culturing and FQ-PCR. Results Totally 18 strains of N.meningitidis were isolated from the throat swabs (3.12%), in which 9 were unspecified strains, 3 were serogroup B strains, 3 were W135 strains, 2 were X strains and 1 was C strain. Totally 46 samples were detected to be positive by FQ-PCR (7.97%). The most common serogroup was B (13), followed by W135 (12), unspecified (11), X (7) and C (3). Conclusion Variety of N.meningitidis serogroups were detected among healthy carriers in surveyed areas with both culturing and FQ-PCR, but the detection rate of FQ-PCR was significantly higher than that of conventional bacterium culturing.
Keywords:    Neisseria meningitidis   carriage rate   bacterium culturing   real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction  

细菌分离培养与实时荧光定量-聚合酶链反应用于健康人群脑膜炎奈瑟菌携带率研究
王颖童1,2, 孙印旗1, 贾肇一1, 何宝花1, 姜霞1, 朱兵清2, 邵祝军2
1. 河北省疾病预防控制中心, 细菌病防治与消毒所, 河北 石家庄 050021;
2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 北京 102206
摘要
目的 了解河北省部分地区健康人群脑膜炎奈瑟菌(Nm)带菌状况,评价实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)作为菌株分离培养法的补充在健康人群带菌调查中的应用价值。 方法 按年龄分层整群随机抽取577人采集咽拭子,采用Nm分离培养和FQ-PCR法同时检测,并使用血清学和分子生物学方法分群。 结果 分离到18株Nm菌株,总阳性率3.12%,其中不可分群最多(9株),其次为B群(3株)、W135群(3株)、X群(2株)、C群(1株)。FQ-PCR检测阳性样本46份,总阳性率7.97%,其中B群最多(13份),其次为W135群(12份)、不可分群(11份)、X群(7份)、C群(3份)。 结论 细菌培养和FQ-PCR均提示这些地区健康人群携带Nm血清群多样化。FQ-PCR检测方法在发现病原体及分群方面比传统菌株分离培养方法都有显著提升,可作为传统方法的有力补充。
关键词:    脑膜炎奈瑟菌   携带率调查   细菌培养   实时荧光定量-聚合酶链反应  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 样本来源
1.2 检测方法
1.3 试剂与仪器
1.4 统计学方法
2 结果
2.1 三市Nm携带检测结果
2.2 不同年龄组阳性结果
2.3 两种试验方法检测阳性率结果比较
3 讨论
　　流行性脑脊髓膜炎(流脑)是由脑膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis，Nm) 感染引起的以脑膜炎和 败血症为主要症状的传染病。患者及健康携带者是 流脑的主要传染源。流脑隐性感染率高，感染后细菌寄生于正常人群鼻咽部，不引起症状而成为带菌者，且不易被发现，带菌者作为传染源的意义更重要[1]，所以人群Nm携带率及菌群特征与流脑的流行具有密切关系。传统Nm分离培养法阳性率低， 实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR)近年来在病原检测领域广泛应用 ，本次健康人群Nm携带率调查同时采用分离培养和FQ-PCR两种方法，并对结果进行比较，以期为今后健康人群Nm携带率调查提供新的思路和检测方法。
1 材料与方法
1.1 样本来源
　　2012年，在河北省石家庄、承德、保定三市各随机选取1个县作为监测点进行健康人群Nm携带率调查。每个监测点人群按照0～、5～、10～、15～、25～、35～、45～岁分为7个年龄组，采取分层整群随机抽样的方式选择受试采样对象，每个年龄组不少于20人，每个监测点不少于160人。最终抽取577人采样，其中石家庄174人、承德242人、保定161人。各年龄组的人数及所占比例依次为93人(16.12%)、108人(18.72%)、84人(14.56%)、91人(15.77%)、70(12.13%)、59人(10.22%)、72人(12.48%)。男性217人，女性360人，各占全部人群的37.61%和62.39%。每个采样对象同时采集2支咽拭子，第1支咽拭子划种巧克力双抗培养基，用于Nm的分离培养；第2支咽拭子直接放入无菌螺口管中用于细菌DNA提取。
1.2 检测方法
　　采样时接种的巧克力双抗平板置于5%CO2 37 ℃环境，培养24～48 h后在其上挑选典型菌落，转种血琼脂培养基，经革兰染色和Api-NH 生化条鉴定Nm，采用玻片凝集法对Nm进行血清分群。采用水煮法提取2号咽拭子DNA。按照参考文献 中FQ-PCR方法和反应条件对提取的DNA样本进行Nm种属特异性FQ-PCR检测和Nm分群检测。用于Nm种属检测目的基因ctrA，Nm分群检测的目的基因分别为A群(sacB)、B群(siaD)、C群(siaD)、W135群(synG)、X群(xcbB)、Y群(synF)。FQ-PCR反应体系：2×Premix 10 μl、上游引物 2 μl、下游引物 2 μl、探针 2 μl、Rox 0.4 μl、超纯水 1.6 μl、DNA模板 2 μl；总体积20 μl。循环条件参考Premix说明书：预变性95 ℃ 2 min； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共50个循环。FQ-PCR反应体系试验结果判定参考文献[5]，当种属鉴定FQ-PCR反应Ct值≤38即可判定为阳性结果，继续进行分群试验；若Ct值在38～40之间，观察扩增曲线形态，如曲线呈对数增长，进行分群试验，结合分群试验的结果综合判定；当Ct值>40，判定为种属检测阴性。
1.3 试剂与仪器
　　 Api-NH生化条由法国生物梅里埃公司生产；上下游引物及探针均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道室提供。美国Stratagene公司生产的Mx3000P型荧光PCR仪。
1.4 统计学方法
　　数据使用Excel软件汇总录入，结果使用SPSS 16.0软件统计。不同年龄组间携带率的差异及两种方法检测结果的差异均采用χ2检验进行分析。
2 结果
2.1  三市Nm携带检测结果
　　调查共分离到18株Nm，总阳性率为3.12%，承德市阳性率最高。其中除9株不可分群菌株外，B群和W135群菌株最多，其次为X群。FQ-PCR共检测到阳性样本46份，总阳性率7.97%。其中B群数量最多(13份)，占28.26%，其次为W135群、不可分群。不同地区菌株分离培养法和FQ-PCR方法具体结果见表1。
2.2 不同年龄组阳性结果
　　全部样本Nm年龄别分离率依次为0～岁组(2.15%)、5～岁组(2.78%)、10～岁组(1.19%)、15～岁组(7.69%)、25～岁组(1.43%)、35～岁组(3.39%)、45～岁组(2.78%)；以15～岁组最高，其次为35～岁组，10～岁组分离率最低。 经χ2检验，差异无统计学意义(χ2=6.377，P>0.05)。FQ-PCR检测ctrA基因年龄别携带率分别为0～岁组(6.45%)、5～岁组(6.48%)、10～岁组(5.95%)、15～岁组(13.19%)、25～岁组(8.57%)、35～岁组(8.47%)和45～岁组(6.94%)，仍以15～岁组最高，其次为25～岁组，10～岁组最低。经χ2检验，差异无统计学意义(χ2=4.618，P>0.05)。两种方法检测结果按年龄别汇总情况见表2。

表1 不同地区Nm分离培养及FQ-PCR检测结果
Table 1 Detection results of culturing and FQ-PCR in different areas
地区 B群 C群 W135群 X群 不可分群 合计阳性数 阳性率(%)
分离培养 FQ-PCR 分离培养 FQ-PCR 分离培养 FQ-PCR 分离培养 FQ-PCR 分离培养 FQ-PCR 分离培养 FQ-PCR 分离培养 FQ-PCR
石家庄1202120021472.304.02
承德 2101114277613285.3711.57
保定 01001600041110.626.83
合计31313312279111846 3.127.97


表2 不同年龄组Nm分离培养及FQ-PCR检测结果
Table 2 Detection results of culturing and FQ-PCR in different age groups
地区 0～岁 5～岁 10～岁 15～岁
检测数 分离培养 FQ-PCR 检测数 分离培养 FQ-PCR 检测数 分离培养 FQ-PCR 检测数 分离培养 FQ-PCR
石家庄4111451021012813
承德 3014381538113868
保定 2201251225032501
合计932610837841591712
地区 25～岁 36～岁 45～岁 合计
检测数 分离培养 FQ-PCR 检测数 分离培养 FQ-PCR 检测数 分离培养 FQ-PCR 检测数 分离培养 FQ-PCR
石家庄1611301200017447
承德 3305342331222421328
保定 210022012103161111
合计7016592572255771846


2.3 两种试验方法检测阳性率结果比较
　　两种检测方法同时阳性、阴性份数为13份和526份，数据进行χ2检验，两种方法的检出率差异有统计学意义(χ2=19.18，P<0.05)，见表3。

表3 FQ-PCR与菌株分离培养结果比较
Table 3 Comparison of results by FQ-PCR and culturing
菌株分离培养法 合计
阳性 阴性
FQ-PCR 阳性 13 33 46
阴性 5526531
合计18559577


FQ-PCR分群结果与血清学结果完全一致，另有3份样本分离到不可分群Nm，而FQ-PCR种属检测结果阳性，进行FQ-PCR分群检测后发现可以分群，2份被分为B群，1份W135群。有5份样本分离到不可分群Nm，但FQ-PCR检测结果阴性。两种方法对比结果见表4。

表4 FQ-PCR与菌株分群结果比较
Table 4 Comparison of results of serogroup typing by FQ-PCR and culturing
血清群分离培养FQ-PCR阳性数
B群++3
-+10
C群++1
-+2
W135群++3
-+9
X群++2
-+5
不可分群++4
-+7
+-5

3 讨论
　　通过本次研究发现，正常带菌者携带的Nm中的可分群Nm(包括菌株分离培养法与FQ-PCR法)仍以B群居首位。脑膜炎奈瑟菌B群带菌率较高，而且目前尚无有效的B群流脑疫苗，一旦易感人群积累到一定程度后，可能发生流脑疫情[6]。本次调查分离到的W135群菌株数量与B群菌株数量持平，W135基因携带数量居第2位。据报道 ，在非洲、欧洲一些国家及我国广东、广西等省(自治区)已经出现W135群Nm引起的病例。目前四价联合疫苗在河北省接种尚未普及，W135群菌株的逐年增多应予以高度重视。另外，本次调查还检出X群菌株2株，同时通过FQ-PCR检测也发现X群特异性基因携带的现象，X群的出现及流行在国内外已有类似报道 。综上所述，本次调查中健康人群Nm携带情况出现了血清群的多样化，这一发现对以后的流脑防控工作具有重要指导意义。
FQ-PCR是一种高灵敏度高特异性的分子生物学检测技术，已用于多种病原菌的快速检测。本次调查采用FQ-PCR方法检出率明显高于菌株分离培养法。研究显示QF-PCR方法最低可检测103拷贝/ml的核酸样本[3]。Nm对干燥、寒冷、热、阳光等非常敏感，在室温中3 h就会死亡，同时受抗生素使用及其他非特异性因素的影响，Nm菌株成活条件苛刻导致Nm检出率低下。而FQ-PCR不受以上因素的影响，对样本采集和运输温度时间等均无特殊要求。菌株培养法主要依靠操作者的主观判断，操作过程不易标化，而FQ-PCR通过收集到的荧光进行定量分析，结果更加客观准确，对操作者的经验要求也较低，易于普及。在样本分群方面，由于不可分群菌株的日益增多，血清学方法能够分群的菌株数量有限，不利于准确地反应Nm在人群中的传播现状。而不可分群的菌株只是血清群表型表达存在缺陷，从基因检测的角度仍然可以成功分群，这就决定了FQ-PCR在分群方面的优势。所以FQ-PCR方法在Nm种属及分群检测中都可提高灵敏度。此外，FQ-PCR方法还具有试验周期短时效性强、自动化程度高、污染环节易于控制等优点。但同时应该注意本次调查中有5份培养出不可分群菌株的样本FQ-PCR检测呈阴性。曾有报道提出，不可分群菌株具备群特异性基因，表现为群特异性基因扩增阳性，但是操控荚膜蛋白表达的cps基因中有缺失、插入或滑移错配，使其荚膜不能正常表达，表现为血清不可分群 。而荚膜转运基因ctrA(本研究中用于Nm种属鉴定的靶基因)位于cps基因区域内，这很可能是造成不可分群菌株检测不到ctrA基因的原因。所以ctrA基因在检测Nm携带方面仍存在一定漏检可能性。另应注意，有3份样本分离到不可分群Nm，其对应样本基因检测结果为2份B群和1份W135群，其原因很可能也是荚膜表达缺陷所致。可见基因分群结果，由于只取决于碱基组成，忽略了基因表达过程对表型形成的影响，并不能完全代表其生物表型。综上所述，FQ-PCR方法在Nm携带检测中对传统菌株分离培养法是有力的补充，但不能完全替代。建议在今后的调查工作中可以同时使用两种方法，以便提高结果的准确性。

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