弗氏枸橼酸杆菌在自然界广泛存在，是人类和动物肠道的正常菌群。弗氏枸橼酸杆菌可以引起包括腹泻在内的多种感染 性疾病，如尿道感染、脑膜 炎、脓毒症以及医院获得性感染等 。国外有 在食品中分离到弗氏枸橼酸杆菌的相关报道，我国的多个研究中表明食品中弗氏枸橼酸杆菌也有较高的分离率 。另外，我国有文献报道 ，一些食物中毒或腹泻患者的粪便标本中，不能分离到常见的致病菌，却能分离到弗氏枸橼酸杆菌。虽然有弗氏枸橼酸杆菌引起腹泻的报道，但是与其他肠道病原菌如大肠埃希菌、沙门菌、痢疾杆菌等相比，弗氏枸橼酸杆菌引起腹泻的报道很少。这可能与临床样本筛查中，很少将弗氏枸橼酸杆菌作为常规筛查的菌株有关。
目前还没有特异的弗氏枸橼酸杆菌的筛选培养基，弗氏枸橼酸杆菌的鉴定也主要通过常规的生化反应。为了快速特异的检测和鉴定弗氏枸橼酸杆菌，我们根据弗氏枸橼酸杆菌的特异基因建立了弗氏枸橼酸杆菌灵敏、特异的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real time-PCR)检测方法。 1.1 材料
1.1.1 菌株来源
　　弗氏枸橼酸杆菌、杨氏枸橼酸杆菌、布氏枸橼酸杆菌、科氏枸橼酸杆菌、罗氏枸橼酸杆菌、肠产毒素性大肠埃希菌(Enterotoxigenic E. coli, ETEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(Enteroinvasive E. coli, EIEC)、肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic E. coli, EPEC)、肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhage E. coli, EHEC)、肠集聚性大肠埃希菌(Enteroaggregative E. coli, EAEC)、阪崎肠杆菌、单增李斯特菌、粘质沙雷菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和产气肠杆菌为本科室保存。
用于特异性检测的其他细菌核酸由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所各科室提供，包括甲型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、羊布鲁氏菌、流感嗜血杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、汉赛巴尔通体、结核分枝杆菌及金黄色葡萄球菌等。
1.1.2  主要试剂与仪器设备
　　Premix Ex Taq^TM Kit、PCR产物克隆试剂盒(pMD20-T Vector)、DL2000 DNA Marker和EasyDilution均购自宝生物工程(大连)有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒(Wizard^ Genomic DNA Purification Kit)购自Promega公司。PCR产物胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)购自德国Qiagen公司。NanoDrop ND-1000分光光度计为美国Thermo公司产品。Gel Doc 2000凝胶成像系统为美国伯乐公司产品。Rotor Gene Q实时荧光定量PCR仪为德国Qiagen公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引物和探针的合成
　　根据本实验室完成的弗氏枸橼酸杆菌测序菌株信息寻找弗氏枸橼酸杆菌的特异基因，最终确定tct基因为弗氏枸橼酸杆菌的特异基因。选择其稳定的保守区域作为检测靶标序列，应用Primer Express 3.0软件设计引物和探针(表1)。引物和探针均由上海基康生物公司合成。
1.2.2  菌株基因组DNA的提取
　　菌株基因组DNA 的提取使用Promega公司的Wizard Genomic DNA

表1 引物与探针序列
Table 1 Primers and probe sequences of real-ime PCR to detect Citrobacter freundii

引物及探针名称	序列(5′~3′)	扩增产物大小(bp)
TCT-F	GCA GGA CAG GAA GCG TCT G
TCT-R	CAG CCG ACC ATC TTT TAC ATA GC	126
TCT-Probe	AGC CGC TGA ACG ACT TCC AGA CCA

Purification Kit，按照说明书进行操作。使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定细菌基因组DNA的纯度和浓度，基因组DNA少量分装，-20 ℃保存备用。
1.2.3 质粒标准品的制备
　　 以表1引物，扩增目的基因126 bp，切胶回收，纯化PCR产物；然后连接到pMD20T载体并转化JM109感受态细胞；筛选阳性克隆子，测序验证。提取质粒，根据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度；每μl样品中检测基因的拷贝数=浓度(ng/μl)×阿佛加德罗常数×10^-9／(660×重组质粒碱基数)。用EasyDilution将上述质粒依次稀释成1.0×10⁰～1.0×10⁹拷贝／μl，共10个浓度梯度。
1.2.4 普通PCR反应体系
　　普通PCR反应总体系为20 μl，含10×Buffer(Mg²⁺ plus) 2 μl、dNTPs (10 mmol/L) 1 μl、 ExTaq DNA 聚合酶0.2 μl、上下游引物(10 μmol/L)各1 μl、模板DNA 1 μl、无菌水13.8 μl。PCR循环参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；72 ℃延伸7 min。同时用无菌水代替模板DNA作为空白对照。反应结束后，取5 μl PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上观察结果。
1.2.5 TaqMan real time-PCR反应体系
　　实时荧光TaqMan PCR反应总体系为20 μl，含2×Premix Ex Taq^TM 10 μl；上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，Reverse primer(10 μmol/L)0.4 μl，BHQ-Probe(10 μmol/L)0.4 μl，模板DNA 1.0 μl，无菌水7.8 μl。在Rotor Gene Q实时荧光定量PCR仪上扩增并测定结果。荧光定量PCR循环参数：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的Ct(cycle threshold)值。
1.2.6 特异性评价
　　以常见致病菌及条件致病菌DNA 为模板评价TaqMan实时荧光PCR体系的特异性。
1.2.7  牛奶模拟样本的检测
　　取振荡过夜的弗氏枸橼酸杆菌50 μl接种于5 ml LB培养液中，摇菌至A值为0.60，菌落计数为5.0×10⁸。首先使用 磷酸盐缓冲液 将菌液原液稀释至1.0×10⁸，然后磷酸盐缓冲液连续10倍稀释为1.0×10⁰~1.0×10⁷cfu/ml。将各个稀释度的菌液污染牛奶，并参照文献的方法^[8]提取细菌核酸：取l ml牛奶，加入0.1 ml各个稀释度的菌液，取100 μl奶样分别加入0.05 mg蛋白酶K、50 μl 0.1％Triton X-100，混匀，37 ℃ 30 min，加入900 μl 150 mmol／L NaCl，反复混匀，13 000 rpm离心10 min，小心弃去上清，取沉淀用100 μl 150 mmol／L NaCl重悬。提取基因组DNA，平行检测3次。
1.2.8 稳定性评价
　　对浓度为1.0×10⁷、1.0×10⁵及1.0×10²的质粒标准品一个批次内重复检测10次以计算其组间变异系数；不同批次重复检测10次以计算其组间变异系数。 2.1 目的基因片段的克隆和验证
　　实验获得的tct基因扩增片段分子质量大小与预期结果一致。将所得片段转入T载体中，经测序验征，所获阳性克隆包含的目的片段序列完全相同。
2.2 TaqMan real time-PCR检测方法的灵敏度
　　将质粒标准品进行普通PCR扩增显示，当每反应体系中重组质粒的模板数降到10⁴拷贝/μl以下时，普通PCR扩增后未出现目的条带 (图1)。

图1 普通PCR对弗氏枸橼酸杆菌tct基因检测的灵敏度
Figure 1 Sensitivity of conventional PCR to detect tct gene of Citrobacter freundii   注：M为分子量Marker; 1~9分别是模板量为1.0×10⁸～1.0×10⁰拷贝/μl的质粒标本；10为阴性对照。
用与普通PCR检测方法相同的质粒稀释梯度作为模板进行实时荧光PCR检测的结果显示：当质粒标准品浓度为1.0×10⁸～1.0×10¹拷贝/μl时，均有阳性扩增。在该TaqMan实时荧光PCR检测方法体系中，靶基因扩增反应的Ct值与模板浓度之间存在良好的线性关系，相关系数为0.998(图2、3)。

图2 TaqMan实时荧光PCR对弗氏枸橼酸杆菌tct基因检测灵敏度
Figure 2 Sensitivity of real-time TaqMan PCR to detect tct gene of Citrobacter freundii

图3 实时荧光TaqMan PCR检测弗氏枸橼酸杆菌tct基因的标准曲线
Figure 3 Standard curve of real-time TaqMan PCR to detect tct gene of Citrobacter freundii
为了更好的评价该TaqMan real time-PCR检测方法的检测下线，我们对质粒标准品浓度为1.0×10³～1.0×10⁰拷贝/μl三个稀释浓度分别进行了4次平行实验。结果1.0×10¹拷贝/μl的4次反应均有检测信号。因此我们认为检测下限为1.0×10¹拷贝/μl。
由此可见，我们建立的实时荧光PCR检测方法对弗氏枸橼酸杆菌质粒标准品的检测灵敏度比普通PCR方法高1000倍。
2.3 TaqMan real time-PCR检测的特异性
　　除48株弗氏枸橼酸杆菌外,其他30种肠道病原菌及院内感染的常见致病菌，包括杨氏枸橼酸杆菌、布氏枸橼酸杆菌、科氏枸橼酸杆菌、罗氏枸橼酸杆菌、ETEC、EIEC、EPEC、EHEC、EAEC、阪崎肠杆菌、单增李斯特菌、粘质沙雷菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌、产气肠杆菌、甲型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、羊布鲁氏菌、流感嗜血杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、汉赛巴尔通体、结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌均未出现特异扩增(表2)。说明该检测方法特异性很好。

表2 实验菌株及TTRP检测结果
Table 2 Strains of this study and TaqMan PCR results of tct gene

菌株名称	拉丁名称	来源	菌株数	tct基因阳性菌株数
弗氏枸橼酸杆菌	Citrobacter freundii	ATCC 43864及分离株	48	48
杨氏枸橼酸杆菌	Citrobacter youngae	ATCC 29220及分离株	50	0
布氏枸橼酸杆菌	Citrobacter braakii	分离株	9	0
科氏枸橼酸杆菌	Citrobacter koseri	ATCC BAA-895	1	0
罗氏枸橼酸杆菌	Citrobacter rodentium	ATCC BAA-352	1	0
肠集聚性大肠埃希菌	Enteroaggregative E. coli	17-2 和EcO422	2	0
肠出血性大肠埃希菌	Enterohemorrhage E. coli	EDL933及分离株	90	0
肠侵袭性大肠埃希菌	Enteroinvasive E. coli	CMCC 44825	1	0
肠致病性大肠埃希菌	Enteropathogenic E. coli	2348/69	1	0
肠产毒性大肠埃希菌	Enterotoxigenic E. coli	10407	1	0
鼠伤寒沙门菌	Salmonella typhimurium	ATCC CT18及分离株	2	0
甲型副伤寒沙门菌	Salmonella paratyphi	ATCC 9150	1	0
肠炎沙门菌	Salmonella enteritidis	CMCC 50336	1	0
小肠结肠炎耶尔森菌	Yersinia enterocolitica	ATCC 23715	1	0
阪崎肠杆菌	Enterobacter Sakazakii	分离株	1	0
羊布鲁氏菌	Brucella melitensis	分离株	1	0
流感嗜血杆菌	Haemophilus influenzae	分离株	1	0
坂崎肠杆菌	Enterobacter Sakazakii	ATCC 45401	1	0
福氏志贺菌	Shigella flexneri	分离株	10	0
类志贺邻单胞菌	Plesiomonas shigelloides	ATCC 51903	1	0
嗜水气单胞菌	Aeromonas hydrophila	分离株	1	0
铜绿假单胞菌	Pyocyanic pneumonia	ATCC 15442	1	0
嗜水气单胞菌	Aeromonas hydrophila	ATCC 7966	1	0
结核分枝杆菌	Mycobacterium tuberculosis	分离株	1	0
汉赛巴尔通体	Bartonella henselae	分离株	1	0
单增李斯特菌	Listeria monocytogenes	CMCC 54003	1	0
金黄色葡萄球菌	Staphyloccocus aureus	ATCC 6538	1	0
产气肠杆菌	Enterobacter aerogenes	ATCC 13048	1	0
阴沟肠杆菌	Enterobacter cloacae	ATCC 13047	1	0
阴沟肠杆菌	Enterobacter cloacae	分离株	1	0
粘质沙雷菌	Serratia marcescens	分离株	1	0

2.4 TaqMan real time-PCR方法检测弗氏枸橼酸杆菌的组内和组间特异性
　　分别选取高、中、低3个浓度的质粒标准品进行重复检测以确定本方法的组内和组间变异系数。在同一批次试验中重复检测1.0×10⁷、1.0×10⁵和1.0×10³三个浓度的质粒标准品10次，计算其组内变异系数为1.31%~1.66%；不同批次重复检测1.0×10⁷、1.0×10⁵和1.0×10³三个浓度的质粒标准品10次，确定其组间变异系数为2.11%~2.45%。
2.5 牛奶模拟样本检测结果
　　当1 ml牛奶加入的菌量为1.0×10⁸～1.0×10⁰cfu/ml时，用TaqMan实时荧光PCR体系检测结果，如图中1~7模板量依次为1.0×10⁸～1.0×10²cfu/ml的菌量；NTC是空白对照。在该PCR检测方法中，靶基因扩增反应的Ct值与菌量稀释度之间均存在良好的线性关系，相

图4 TaqMan real time-PCR对牛奶模拟标本中弗氏枸橼酸杆菌tct基因检测灵敏度
Figure 4 Sensitivity of real-time TaqMan PCR to detect tct gene of Citrobacter freundii in artificially contaminated milk
关系数为0.998，提示实时荧光PCR检测方法对牛奶模拟样本中弗氏枸橼酸杆菌检测下线为1.0×10² cfu/ml的菌量。 　　弗氏枸橼酸杆菌作为人类肠道的共生菌，很少被人们所关注。但是近年来在食品和腹泻患者的粪便中不断分离到弗氏枸橼酸杆菌，提示弗氏枸橼酸杆菌可能是一种潜在的病原菌 。目前，还没有特异的弗氏枸橼酸杆菌的筛选培养基，弗氏枸橼酸杆菌的鉴定主要依靠传统的生化鉴定方法，此种方法费用高，耗时长，主观因素影响大。
TaqMan real time-PCR技术由于其自身的优势被广泛应用于多种病原微生物的检测工作，与普通PCR方法不同的是，TaqMan real time-PCR在普通PCR的基础上加入一条特异的荧光探针，其对引物与模板的同源性要求也高于普通PCR，因此real time-PCR方法比普通PCR法具有更高的特异性。本研究针对弗氏枸橼酸杆菌的保守基因设计引物和荧光探针，建立了弗氏枸橼酸杆菌TaqMan real time-PCR检测方法，与传统的分离培养、生化鉴定的方法相比，本实验建立的 TaqMan real time-PCR方法1天内即可完成对弗氏枸橼酸杆菌的检测工作。我们通过对质粒标准品的检测发现该体系检测的灵敏度明显高于普通PCR。该体系在区分弗氏枸橼酸杆菌与其他30种肠道病原菌及院内感染的常见致病菌中具有很高的特异性。通过对牛奶模拟标本的检测证明本体系在牛奶模拟标本中的检测下限为10×10²cfu/ml。
目前，在国内外研究中，还没有对弗氏枸橼酸杆菌进行荧光定量PCR检测方法的报道。本研究建立的TaqMan real time-PCR方法为临床标本的检测提供了可靠的技术依据，通过检测牛奶模拟标本中的弗氏枸橼酸杆菌，为在食品中检测弗氏枸橼酸杆菌提供了基础。但是本实验建立的方法应用效果还需要更多标本的验证。另外TaqMan real time-PCR方法对仪器设备、实验环境、实验试剂及耗材和实验人员的操作等均有一定的要求，这限制了此方法在基层实验室的应用。

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