Detection of Laribacter hongkongsis in freshwater products in Jiangmen, Guangdong
HU Jing1, ZHU Jiang-feng1, ZHENG Nan-cai2, CHEN Qing1, LIU Zhi-hua3, WU Min1, ZHANG Ou1, FENG Jia-li1, CHEN Bing1
Department of Epidemiology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China
Abstract
Objective To investigate the contamination status of Laribacter hongkongsis in freshwater products in Jiangmen, Guangdong province. Methods A total of 161 freshwater product samples were collected from three food markets in Jiangmen during July-August 2010. Laribacter hongkongsis strains were isolated by using modified Mac-Lonkey Agar. The positive samples in biochemical tests were further identified by specified PCR. The 16S rRNA of 5 isolates were sequenced and analyzed. Results A total of 20 Laribacter hongkongsis strains were detected from the 161 samples.The overall positive rate was 8.05%. The positive rate was 30.1% in grass carp (19/63) and 1 of 5 tigrina frogs was positive. Conclusion The contamination of Laribacter hongkongensis was detected in freshwater products in Jiangmen, especially in grass carp and tigrina frog. To ensure the food safety, it is necessary for health department to strengthen the monitoring of Laribacter hongkongsis contamination in freshwater products.
广东省江门市淡水产品中香港海鸥菌的检测
胡静1, 朱江峰1, 郑南才2, 陈清1, 刘志华3, 吴敏1, 张欧1, 冯嘉丽1, 陈冰1
1. 南方医科大学流行病学系, 广东 广州 510515;
2. 广东省江门市疾病预防控制中心;
3. 南方医科大学附属南方医院感染内科
2. 广东省江门市疾病预防控制中心;
3. 南方医科大学附属南方医院感染内科
摘要
目的 了解广东省江门市淡水产品中香港海鸥菌污染的状况。 方法 于2010年7—8月共采集江门市3家农贸市场6个不同品种的淡水产品共计161份进行检测,检样接种改良头孢派酮MacConkey琼脂(CMA)平板培养分离可疑菌株,经革兰染色、生化实验、特异性片段 PCR 扩增进行香港海鸥菌的鉴定,并选取5株进行了16S rRNA 基因序列测定和比对分析。 结果 161份检样中共检出香港海鸥菌20株,总阳性率为8.05% (20/161), 其中香港海鸥菌在草鱼的阳性率为30.1%(19/63),5只虎纹蛙中检出1只阳性。 结论 江门市淡水产品中存在香港海鸥菌的污染,草鱼和蛙类可能是污染的重要来源,应加强监测和预警。
内容大纲
-
1 材料与方法
- 1.1 标本来源
- 1.2 实验试剂
- 1.3 标本的处理
- 1.3.1 草鱼、虎纹蛙的标本处理
- 1.3.2 河蚌、白蚬和石螺的标本处理
- 1.4 细菌的培养与鉴定
- 1.4.1 细菌培养
- 1.4.2 生化实验
- 1.4.3 特异性片段聚合酶链反应(PCR)
- 1.4.4 16S rRNA 扩增与测序
- 2.1 淡水产品中香港海鸥菌的检测结果
- 2.2 生化反应结果
- 2.3 PCR检测结果
由于广东省毗邻香港，自然生态和社会生态与香港很相似，存在LH感染的危险因素。广东省江门市于2009年7月,从1名本地的社区获得性腹泻患者中分离到广东省首株香港海鸥菌[4]。为了解广东省江门市淡水鱼类产品中香港海鸥菌的污染状况， 笔者于2010年7—8月对广东省江门市某零售市场采集的淡水产品中香港海鸥菌的情况进行了流行病学调查。
1 材料与方法
1.1 标本来源 采集江门市3家农贸市场161份新鲜淡水生物，包括草鱼63条、武昌鱼18条、虎纹蛙5只、河蚌10只、白蚬23只、石螺42只。现场解剖, 所采样本均用无菌塑料袋独立包装，采集后立即送往实验室检测。
1.2 实验试剂
麦康凯琼脂粉、LB增菌液、头孢哌酮均购于广州环凯微生物科技有限公司；氧化酶、过氧化氢、尿素和精氨酸双水解酶试剂为杭州天和微生物试剂有限公司产品。细菌生化实验条API 20NE为法国生物梅里埃公司产品；PCR相关试剂为TaKaRa产品，引物由上海英俊公司合成。
1.3 标本的处理
1.3.1 草鱼、虎纹蛙的标本处理
无菌条件下剪开腹部，取出并剖开全肠，剪断其中后肠，用棉拭子反复涂抹内肠壁后，直接划线接种于改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)平皿，头孢哌酮浓度为16 mg／L。CMA培养皿置37 ℃培养箱培养48 h。
1.3.2 河蚌、白蚬和石螺的标本处理
在无菌条件下将其软体部分与硬壳分离，剪碎软体部分后直接按1.3.1所述方式增菌。
1.4 细菌的培养与鉴定
1.4.1 细菌培养
根据LH在麦康凯平板上的菌落形态(浅灰色、半透明圆形、略凸起、直径在1.0~1.5 mm之间的光滑菌落)挑取可疑菌落接种营养琼脂平板分纯，置37 ℃恒温箱培养24 h。HKU1菌株(香港大学微生物学系袁国勇教授惠赠)作为阳性对照菌株，大肠埃希菌ATCC25922(本室保存)作为阴性对照菌株。
1.4.2 生化实验
对培养出的可疑细菌参照《北京陆桥技术有限责任公司——香港海鸥菌检测程序》、《香港海鸥菌检测技术的建立与应用》方法及判定标准[5]，进行革兰染色，过氧化氢酶、氧化酶、脲酶、精氨酸双解酶和三糖铁等关键生化试验筛选，形态为阴性短杆菌或弧菌，并同时符合过氧化氢酶、氧化酶、脲酶阳性、精氨酸双解酶和三糖铁阴性者，再采用 API 20NE 做进一步的生化实验。
1.4.3 特异性片段聚合酶链反应(PCR)
扩增目的片段是香港海鸥菌 16S rRNA 基因特异部分序列，引物设计参照文献[5]，序列为：P2F: 5′-TTG AGG GTG CCC CGA AAG GGA-3′，P2B: 5′-CTA CCC ACT TCT GGC GGA TT-3′，长度为 426 bp。反应体系: 总体积 50 μl，其中，10 × PCR 缓冲液 (内含 Mg2 +) 5 μl，2 mmol/L 三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs) 4 μl，5 U/μl 的Taq DNA 聚合酶 1 μl，引物各1 μl，模板 DNA 2 μl，ddH2O 36 μl。反应条件: 94 ℃ 5 min预变性; 94 ℃ 30 s; 53 ℃ 40 s; 72 ℃ 40 s; 35 个循环；延伸72 ℃ 5 min。
1.4.4 16S rRNA 扩增与测序
PCR 方法同上，引物设计参照文献[1] ,扩增 16S rRNA 基因序列，序列为: LPW264: 5′-GAG TTT GAT CMT GGC TCA G-3′，LPW265: 5′-GNT ACC TTG TTA CGA CTT-3′，长度为1363 bp。PCR扩增产物送上海 Invitrogen 公司进行序列测定。具体鉴定流程见图1。
图1 香港海鸥菌鉴定流程图
Figure 1 Identification of isolated Laribacter hongkongensis strians
2 结果
2.1 淡水产品中香港海鸥菌的检测结果采集检测的161份样品结果显示，共检出香港海鸥菌20株，总阳性率为8.05％。其中草鱼的阳性率最高为30.1％(19／63)，5只虎纹蛙中检出1只阳性，武昌鱼、河蚌、白蚬、石螺等淡水产品中未检出。
2.2 生化反应结果
淡水产品中分离到的20株香港海鸥菌均为革兰阴性菌，氧化酶阳性、过氧化氢酶阳性、脲酶阳性，精氨酸双解酶阳性，三糖铁阴性，进一步API 20NE生化实验结果见表1。
2.3 PCR检测结果
特异性PCR和16S rRNA扩增均可见明亮的条带，且与目的片段大小一致，见图1。随机选取5株进行16S rRNA测序，并采用Blast软件对测序结果进行比对，与Yuen等[1]报道香港海鸥菌标准株HKU1(GenBank登录号:AF389085)相应序列的一致性达99%~100%。
表1 香港海鸥菌分离株生化试验结果
Table 1 Biochemical test results of isolated Laribacter hongkongsis strains
| 检验项目 | 结果 | |
| HKU1 | 分离株 | |
| 硝酸盐还原(NO3) | + | + |
| 色氨酸(TRP) | - | - |
| 葡萄糖酸化(GLU) | - | - |
| 细胞色素氧化酶(OX) | + | + |
| 脲酶(URE) | + | + |
| 七叶灵水解(ESC) | - | - |
| 明胶酶(GEL) | - | - |
| β-半乳糖苷酶(PNPG) | - | - |
| 葡萄糖(GLU) | - | - |
| 阿拉伯糖(ARA) | - | - |
| 甘露糖(MNE) | - | - |
| 甘露醇(MAN) | + | + |
| 乙酰氨基葡萄糖(NAG) | - | - |
| 麦芽糖(MAL) | - | - |
| 葡糖酸盐(GNT) | + | + |
| 癸酸盐(CAP) | + | + |
| 已二酸(ADI) | - | - |
| 苹果酸盐(MLT) | - | - |
| 柠檬酸盐利用(CIT) | - | - |
| 乙酸苯酯(PAC) | - | - |
| 精氨酸双水解酶(ADH) | + | + |
图2 江门市香港海鸥菌分离株PCR扩增结果
Figure 2 PCR amplification results of isolated Laribacter hongkongsis strians in Jiangmen
3 讨论
自香港海鸥菌2001年被发现至今的10余年时间里，有关国内外学者给予了一定的关注,并分别从病原学、流行病学等诸多方面展开研究。
香港学者在约25%淡水鱼的肠道内分离到香港海鸥菌 ，且研究发现，在淡水鱼中的分布与季节等有关[7]，春夏季高于秋冬季。随后，Lau等[8]从2004年12月至2006年11月对香港居民饮用水源水共10个采水点进行环境水体检测, 结果6份环境水体中分离到香港海鸥菌, 并分析出在环境温度及水温较高的夏季分离率高。其后的进一步研究还发现淡水蛙类的肠道内也存在香港海鸥菌，其携带率高达80％以上[9]。上述结果提示，食用淡水鱼、蛙和饮用生水可能是感染香港海鸥菌的危险因素之一。
由于广东省江门市地处珠江三角洲地区，属亚热带气候，温热多雨，居民素喜食鱼、虾、蟹等淡水产品，有食鱼生、鱼肠、烧烤鱼等饮食习惯，因此存在引发人群食源性疾病的潜在危险。根据文献[7]报道，该菌不能在氯化钠>3%的环境中生长，也未在海水鱼中检出，故本次研究的对象主要是市售的淡水产品。 本研究共采集江门市3家菜市场的6个不同品种共计161份淡水生物标本，在草鱼中香港海鸥菌检出率为30.1%(19/63)，并在5只虎纹蛙中检出1只阳性，这是我国内地蛙类香港海鸥菌检出的首次报道，提示草鱼和蛙类可能是感染的重要淡水产品来源。为在最大程度上降低由香港海鸥菌所致食源性疾病暴发的可能性，应避免食用未经煮熟的淡水鱼及其制品,要生熟分开，避免交叉污染。
近年来，我国内地也有多省(市、自治区)报告了香港海鸥菌在淡水鱼的检出情况，如广东、广西、河北、北京、杭州、台州、深圳等 均在淡水鱼中检出了香港海鸥菌，由于可能受采样时间、地点不同，细菌分离培养和检测技术难以完全标准化的影响，各地的检出结果迥异不同，但这些研究结果足以提示我们，香港海鸥菌的污染已经覆盖多省市，对其研究应给予足够的重视，加强对淡水产品中香港海鸥菌污染的监测，加强疾病预警和相关健康教育对预防控制人群感染具有重要意义。
参考文献
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