疾病监测, 2013, 28(7): 541-544
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.7.008
Etiology of hand foot and mouth disease and molecular epidemiology of enterovirus 71 in Hangzhou, 2011-2012
ZHAO Shi-yong1, WEI Yi1, JIANG Mao-ying1, TENG Shu1, SHAO Qi-ming1, CUI Da-wei2, XIE Guo-liang2, CHEN Yu2
Hangzhou Children's Hospital, Hangzhou 310014, Zhejiang, China
Abstract
Objective To understand the etiological characteristics of hand foot and mouth disease (HFMD) and the molecular epidemiological characteristics of enterovirus 71 (EV71) in Hangzhou. Methods Stool specimens and related clinical data were collected from 210 suspected HFMD cases. Real-time RT-PCR was conducted to detect EV71 and coxsackie virus A16 (Cox A16). The positive specimens were used for VP1 gene sequencing. Results The real-time RT-PCR assay indicated that the positive rates of EV71, Cox A16 and other enterovirus in 210 specimens from suspected HFMD cases were 60.95% (128/210), 21.43% (45/210) and 9.05% (19/210) respectively. The sequence analysis showed that the VP1 gene of 10 EV71 strains shared homology of 95.7%-98.0% with JX509922, JX509924, JX509926, JX509927, JX509928 and JX509929 strains. The phylogenetic analysis revealed that 10 EV71 strains belonged to subtype C4a. Conclusion EV71 and Cox A16 were the major pathogens of HFMD in Hangzhou. It is necessary to improve the surveillance of EV71 and Cox A16, especially EV71, for the better prevention and control of HFMD.
Keywords:    hand foot and mouth disease   enterovirus 71  

2011-2012年杭州市手足口病的病原构成及肠道病毒71型的分子流行病学特征
赵仕勇1, 韦翊1, 蒋茂莹1, 滕淑1, 邵启明1, 崔大伟2, 谢国良2, 陈瑜2
1. 杭州市儿童医院感染科, 浙江 杭州 310014;
2. 浙江大学医学院附属第一医院检验科
摘要
目的 探讨杭州市手足口病病原谱构成及其肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)的分子特征。 方法 采集210例疑似手足口病感染者的粪便标本及其相关临床资料,采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)方法进行初步检测,利用RT-PCR扩增部分EV71和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16, Cox A16)阳性样本VP1基因区并测序分析。 结果 荧光定量RT-PCR检测表明,210例疑似感染者的粪便中, EV71、Cox A16 和其他肠道病毒的阳性率分别为60.95%(128/210)、21.43%(45/210)和9.05%(19/210)。10株EV71病毒VP1区核酸序列与JX509922、JX509924、JX509926、JX509927、 JX509928和 JX509929的同源性最高为95.7%~98.0%,且均属于EV71中 C4a亚型。 结论 EV71和Cox A16是杭州市儿童手足口病的主要病原体。因此加强EV71和Cox A16的监测特别是EV71的检测,有助于更好地预防和控制手足口病。
关键词:    手足口病   病原构成   EV71型  

内容大纲
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.2 方法
1.2.1 病毒RNA核酸提取
1.2.2 EV核酸检测
1.2.3 EV71 VP1基因扩增
1.2.4 EV71 VP1基因序列测定和进化分析
1.3 统计学分析
2 结果
2.1 实时荧光定量RT-PCR检测疑似HFMD儿童
2.2 RT-PCR扩增EV71病毒VP1基因区
2.3 EV71-VP1基因的核苷酸序列同源性及系统进化树构建
3 讨论
　　手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)是婴幼儿常见传染病，由多种肠道病毒 (eterovirus, EV) 感染引起。大多数患儿症状较轻，仅出现发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹等症状，少数患者可导致心肌炎、无菌性脑膜脑炎等并发症，特别是肠道病毒71型(hman eterovirus 71，EV71)能够引起中枢神经系统疾病，甚至引起死亡 。其中EV71和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16, Cox A16)为引起HFMD的最常见病原 。
为探讨杭州地区HFMD的病原构成，对2011年4月至2012年9月采集的共210例疑似HFMD感染者的粪便标本进行了EV核酸检测，并结合病例临床信息对结果进行分析。
1 对象与方法
1.1 研究对象
　　采集浙江省杭州市儿童医院和浙江省儿童医院的210例疑似HFMD感染者的粪便标本，其中男性113例，女性97例，年龄10月龄至7岁，平均(2.8±1.5)岁。标本置-80 ℃冰箱冻存待检。
1.2 方法
1.2.1 病毒RNA核酸提取
　　采用Geneaid公司的病毒RNA核酸提取试剂盒进行EV核酸提取，按照试剂盒说明书操作, 收集病毒RNA提取液50 μl，保存于-80 ℃备用。
1.2.2 EV核酸检测
　　采用江苏默乐生物科技有限公司的HFMD一步法三色反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测试剂盒，进行EV71、Cox A16和其他EV的核酸检测，实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)的反应体系和反应条件参照其操作说明书进行。
1.2.3 EV71 VP1基因扩增
　　扩增EV71 VP1基因区的引物利用Primer Premier 5.0引物设计软件，根据HM002489序列设计如下，EV71-VP1正向引物：ggt gcg ccc aac aca gct t，EV71-VP1反向引物：ccg ccg caa tca cca ggt t，扩增片段大小为1334 bp(包含EV71-VP1基因区)。RT-PCR反应体系(TaKaRa 一步法RT-PCR试剂盒)为：10×One Step RNA PCR Buffer 为2.5 μl，dNTP Mixture为2 μl，MgCl2 (25 mmol/L)为5 μl， RNase Inhibitor和AMV RTase XL及AMV-Optimized Taq(5 U/ml)均为0.5 μl，上、下游特异性引物(20 μmol/L)各为0.5 μl，模板RNA为5 μl，灭菌去离子水补足至终体积为25 μl。RT-PCR反应条件为：反转录(50 ℃)30 min，预变性 (94 ℃) 5 min，40个扩增循环(94 ℃变性15 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s)，72 ℃延伸7 min。RT-PCR产物应用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.2.4 EV71 VP1基因序列测定和进化分析
　　利用DNA凝胶回收试剂盒，对随机选择的10株EV71 VP1基因扩增阳性产物进行纯化回收，并送上海生工生物技术有限公司进行基因序列测定。测序结果将引物序列去除后，应用DNAMAN (5.1.0.0)软件进行序列的拼接、比对和分析，然后应用Mega 4.0软件VP1基因核苷酸序列进行同源性分析并绘制系统进化树。所用参考毒株的基因序列均来源于GenBank。
1.3 统计学分析
　　采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，对年龄和性别分别采用t 检验和χ2检验进行分析。
2 结果
2.1 实时荧光定量RT-PCR检测疑似HFMD儿童
　　 对210例疑似HFMD感染者标本进行荧光定量RT-PCR检测中， EV71、Cox A16和其他EV的阳性率分别为60.95%(128/210)、21.43%(45/210)和9.05%(19/210)。EV71的阳性检测率显著高于Cox A16的检出率(χ2=67.711，P<0.001)和其他EV的检出率(χ2=124.343，P<0.001)；在男女疑似患儿中，EV71的阳性检出率也显著高于Cox A16的检出率(男:χ2=40.115，P<0.001；女: χ2=27.788，P<0.001)和其他EV的检出率(男:χ2=77.241，P<0.001；女:χ2=247.911，P<0.001)，见表1。此外，<5岁患儿EV71的阳性检出率均显著高于≥5岁患儿(χ2=7.978，P=0.005)，且<5岁患儿的EV71显著高于Cox A16的检出率(χ2=66.924，P<0.001)和其他EV的检出率(χ2=129.970，P<0.001)，见表2。

表1 不同性别患儿的EV检出情况
Table 1 Gender specific EV71 detection result in children with HFMD
性别 样本数 EV71 Cox A16 其他EV
阳性数 阳性率/% 阳性数 阳性率/% 阳性数 阳性率/%
男1137162.832421.2487.08
女975758.762121.641111.34
合计21012860.954521.43199.05


表2 不同年龄患儿的EV检出情况
Table 2 Age specific EV71 detection result in children with HFMD
年龄(岁) 样本数 EV71 Cox A16 其他EV
阳性数 阳性率/% 阳性数 阳性率/% 阳性数 阳性率/%
＜519512463.594422.56168.21
≥515426.6716.67320.00
合计21012860.954521.43199.05


2.2 RT-PCR扩增EV71病毒VP1基因区
　　随机选择通过一步法三色荧光定量RT-PCR检测后为EV71病毒的阳性RNA核酸，对其进行普通RT-PCR扩增。EV71扩增后目的片段大小约为1334 bp, 与预期目的基因片段大小相一致(图1)，而EV71的VP1目的基因区(891 bp)包含于该扩增片段中。

图1 real time RT-PCR扩增EV71病毒VP1基因区
Figure 1 Amplification of VP1 gene of EV71 by RT-PCR
real time RT-PCR扩增EV71病毒VP1基因区
  
注：1：EV71阴性对照； 2～3：EV71-VP1扩增片段；4：DL2000 Marker。

2.3  EV71-VP1基因的核苷酸序列同源性及系统进化树构建
　　 随机选择测序的10株EV71型VP1序列与GenBank 中各EV71亚型株(A、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4)进行核苷酸同源性比较发现，10株EV71型之间的VP1基因区核苷酸的同源性为95.6%～99.9%；与JX509922、JX509924、JX509926、JX509927、JX509928和JX509929的同源性较高为95.7%～98.0%，且均属于EV71中 C4a亚型(图2)。

图2 杭州地区EV71-VP1基因核苷酸系统进化树
Figure 2 Phylogenetic tree of VP1 gene nucleotide of EV71 in Hangzbou
杭州地区EV71-VP1基因核苷酸系统进化树
  
注：本研究分离株用▲表示。
3 讨论
　　手足口病是由多种肠道病毒引起的小儿常见传染病。EV属于小RNA病毒科，根据血清学可分为柯萨奇、埃可病毒、脊髓灰质炎病毒和EV68~71型等，共67个血清型 ，其中尤以EV71和Cox A16为常见，特别是近年来我国大部分地区以EV71流行为主。
EV71为单股正链RNA病毒，其核衣壳主要有VP1、VP2、VP3和VP4组成。其中VP1基因是EV血清型分类的重要依据，直接影响病毒的抗原性 ，因此研究EV71的VP1区基因对于监测病毒变异具有重要的意义。
本次研究中，210例疑似HFMD患儿中，采用一步法三色荧光定量RT-PCR检测表明，EV71和Cox A16的检出之和占EV的82.38% (173/210)，与近年浙江省相关报道的结果一致 。不同年龄患儿的检测结果显示，疑似HFMD患儿的感染以5岁以下儿童为主，EV71的阳性检出率显著高于5岁以上患儿。疑似HFMD患儿的感染性别差异无统计学意义，但无论男女其EV71的检出率均显著高于Cox A16和其他EV的阳性检出率，与国内的其他报道一致 。
以上分析表明，由于婴幼儿的免疫系统尚未完全发育成熟，体内并无相应的保护性抗体，从而导致机体的抵抗力相对较差，容易受到EV的感染。由EV71和Cox A16引起的手足口病在不同地区、不同年份间的发病率存在一定的差异，因此应加强对婴幼儿特别是5岁以下儿童进行EV的病原学检测和分型。
根据VP1编码基因的核苷酸序列可将EV71分为A、B、C三个亚型，我国和亚太其他地区流行的EV71以C4亚型为主 。通过对EV71型VP1区的核苷酸进行同源性比对和遗传进化分析，表明2011 2012年杭州地区EV71型均为C4a亚型，与国内相关报道相符合 。EV71型和Cox A16型病毒特别是EV71的C4a亚型是引起杭州地区小儿HFMD常见的病原。
HFMD的治疗目前尚无特效的抗病毒药物，因此加强对EV特别是EV71和Cox A16型的监测和鉴别诊断，对于预防和控制HFMD的流行和暴发非常重要。

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