结核病是威胁人类健康的重大传染性疾病之一。由于流动人口、艾滋病流行、耐药结核病等因素的影响，使得全球结核病疫情仍很严峻。耐药结核病特别是耐多药结核病(MDR-TB)已成为全球严重的公共卫生问题。喹诺酮类药物是治疗结核病的二线药，在不能耐受一线抗结核药物的结核病患者和MDR-TB患者的治疗中担当着重要角色。然而由于该类药物具有广谱的抗菌活性，且价格低廉，也被广泛应用于一般细菌的感染性治疗。我国喹诺酮类药物滥用的现象较严重，导致结核分枝杆菌对喹诺酮类药物的耐药率呈逐年增高的趋势，影响了MDR-TB患者的治疗效果。
在结核分枝杆菌中，喹诺酮类药物的作用靶点是细菌的DNA旋转酶，通过抑制DNA螺旋酶，阻碍DNA合成从而导致细菌死亡^[1]。DNA旋转酶是由2个A亚单位与2个B亚单位组成的四叠体结构蛋白，其中A亚单位分子质量约为105×10³，由gyrA基因编码。结核分枝杆菌对喹诺酮类药物的耐药，主要与DNA旋转酶的A亚单位基因突变有关^[2]。gyrA基因的QRDR区发生点突变是造成结核分枝杆菌产生耐药性的主要原因。现已报道的gyrA的突变位点共26个，其中21(81%)个位点位于QRDR区域，5(19%)个在QRDR区域外^[3]。在突变频率上，QRDR区域位点发生突变的频率是QRDR区域外位点的128倍。
为了解杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药现状，本次研究采用比例法药敏试验筛选氧氟沙星耐药株，分析氧氟沙星的耐药情况；通过测定gyrA基因的QRDR序列，分析gyrA基因的突变特点，探索结核分枝杆菌对氧氟沙星耐药的分子机制。 1.1 研究对象
　　药敏测试所用菌株为2010年4月至2012年6月杭州市各结核病定点医院分离培养的结核分枝杆菌，共计1242株。结核分枝杆菌H₃₇Rv由浙江省疾病预防控制中心(CDC)结核病参比实验室提供。
1.2 药物敏感性试验
　　以标准菌株H₃₇Rv为对照，采用比例法药物敏感性试验，筛选氧氟沙星耐药株。培养基中氧氟沙星終浓度为2 μg/ml。采用对硝基苯甲酸生长试验和噻吩-2-羧酸肼培养基试验鉴定菌种。
1.3 聚合酶链反应(PCR)扩增
　　在生物安全柜内，用无菌接种环挑取罗氏培养基上的新鲜结核分枝杆菌培养物1~2环至装有200 μl无菌水的离心管中，80 ℃金属浴30 min灭活。采用omega细菌基因组抽提试剂盒提取结核菌基因组，置-20 ℃冻存备用。
gyrA基因QRDR区的扩增选用引物gyrA-F(5′-CAG CTA CAT CGA CTA TGC GA-3′)和gyrA-R(5′-GGG CTT CGG TGT ACC TCA T-3′)。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，30个循环后，72 ℃延伸10 min。16S rRNA基因扩增选用引物16S rRNA-F(5′-TGG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和16S rRNA-R(5′-TAC CGC GGC TGC TGG CAC-3′)。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环后，72 ℃延伸10 min。
1.4 DNA测序
　　PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，送生工生物公司完成测序，测序所用引物与PCR扩增所用引物相同。
1.5 数据分析
　　采用χ²检验研究患者组间差异，P<0.05为差异有统计学意义，统计选用SPSS 13.0软件完成。采用Bioedit软件将测序获得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，利用Clustal W软件进行蛋白质序列的多序列比对。以H₃₇Rv标准株的gyrA基因扩增产物为对照，检测突变位点。 2.1 氧氟沙星耐药情况
　　1242株结核分枝杆菌中，共检测到MDR-TB菌株101株，氧氟沙星耐药株67株，氧氟沙星耐药率为5.39%(67/1242)。67株氧氟沙星耐药株中，单药氧氟沙星耐药率为47.76%(32/67)，异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)和卡那霉素(KM)的耐药率分别为44.78%(30/67)、41.79%(28/67)、35.82%(24/67)、2.99%(2/67)和5.97%(4/67)，同时耐INH和RFP的耐药率为34.33%(23/67)。氧氟沙星耐药株中，检测到广泛耐药(XDR)菌株2株；MDR-TB菌株23株，占MDR-TB菌株的22.77%(23/101)。
氧氟沙星耐药患者中男性55例，女性12例，男女性别比为4.58 ∶ 1，而非氧氟沙星耐药患者组中男女比例为2.86 ∶ 1，二组患者的性别构成差异无统计学意义(P>0.05)。耐药患者年龄在18~88岁之间，平均年龄55岁。把氧氟沙星耐药患者分为0~29岁、30~59岁、≥60岁3个年龄段，各年龄段构成比例分别为14.93%(10/67)，46.27%(31/67)和38.81%(26/67)。氧氟沙星耐药患者中，初治结核患者占58.21%(39/67)。
2.2 gyrA基因QRDR区的突变情况
　　采用针对16S rRNA的引物进行PCR扩增，以检测菌株基因组质量。电泳结果表明，67株耐药菌中有55株菌株的基因组未发生降解，可用于gyrA基因扩增。PCR扩增耐药株gyrA基因的QRDR区域，并进行测序。将测序获得的核酸序列翻译为氨基酸序列后，进行多序列比对。比对结果表明，55株耐药株的gyrA基因的第95位密码子均与H₃₇Rv AGC不同：其中54株的密码子为ACC，导致95Ser→Thr；另1株的密码子为GCC，导致95Ser→Ala，两种突变类型的发生率分别为98.18%和1.82%。除第95位密码子外，还检测到第90位和第94位密码子发生突变，发生率分别为27.27%(15/55)和32.73%(18/55)，未检测到双位点同时发生突变的菌株。90位密码子突变类型单一，均为GCG→GTG，导致Ala→Val。94位密码子有GAC→TAC,GCC,GGC,AAC四种类型，导致Asp→Tyr，Ala，Gly，Asn(表1)。
为了解突变菌株的临床来源，将耐药患者分为两组：第一组为新患者，第二组包括初治失败、复治、复治失败、其他等多种登记类型的患者。90位密码子发生突变的菌株中，8株源自新患者痰样，7株源自第二组患者的痰样，突变菌株的分离率差异无统计学意义(P>0.05)。94位密码子发生突变的菌株中，11株源自新患者痰样，7株源自第二组患者的痰样，突变菌株的分离率差异也无统计学意义(P>0.05)。

表1 氧氟沙星耐药临床分离菌株的gyrA基因突变特征
Table 1 Mutation in gyrA gene in ofloxacin resistant isolates

密码子	核苷酸突变	氨基酸突变	突变菌株数	比例 /%
90	GCG→GTG	Ala→Val	15	27.27
94	GAC→TAC	Asp→Tyr	1	1.82
94	GAC→GCC	Asp→Ala	4	7.27
94	GAC→GGC	Asp→Gly	12	21.82
94	GAC→AAC	Asp→Asn	1	1.82

　　喹诺酮类药物是治疗结核病的二线药，也是联合治疗MDR-TB的核心药物之一。当喹诺酮类药物应用或管理不当时，MDR-TB容易发展为XDR-TB。了解结核病患者中特别是MDR-TB患者中喹诺酮类药物的耐受情况及其分布，对指导临床用药和防止喹诺酮类药物耐药性的出现具有重大意义。本次研究收集的1242株结核分枝杆菌中，共检测到MDR-TB菌株101株，其中23株对氧氟沙星耐药，耐药率为22.77%(23/101)，低于全国平均水平(27.4%)和巴基斯坦的耐药率(42.9%)^[4]，但远高于贵阳市肺科医院(5.2%)^[5]、美国和加拿大(4.1%)^[6]、台湾(20%)^[7]等地的耐药率,可能与区域性用药和患者来源有关。
结核分枝杆菌生长缓慢，传统的药敏检测需要5~12周，不能及时指导临床用药，易导致治疗不完全、扩大性耐药及耐药结核的传播。与传统药敏试验相比，分子生物学方法能大大缩短药敏检测的时间，故建立敏感、快速和特异的检测方法已成为耐药结核病研究的重点。分子药敏实验多针对相关耐药基因的突变位点检测，然而不同地区由于种族、气候、地理环境、用药方案等差异，耐药基因的突变率变化范围大，用分子药敏取代传统药敏存在一定的局限性。因此，为建立适合本地区的分子药敏检测方法，鉴定相关耐药基因的突变类型和突变频率是十分关键的。
现已报道的gyrA基因QRDR区的错义突变主要发生在Ala74、Gly88、Asp89、Ala90、Ser91和Asp94等密码子 ，而本研究中杭州地区氧氟沙星耐药株的QRDR区仅第90、94和95位密码子发生突变。95位密码子的突变率为100%，突变类型包括95Ser→Thr和95Ser→Ala两类，发生率分别为98.18%和1.82%，与Shi等^[9]报道的我国大多数野生结核分枝杆菌都携带95Ser→Thr(AGC→ACC)突变位点的现象一致。Shi等^[9]、Takiff等^[10]曾报道gyrA基因第95位密码子具有自然多态性，故该位点的突变与氧氟沙星耐受性无关。杭州地区氧氟沙星耐药株第94位密码子有4种类型的突变(Asp→Tyr，Ala，Gly，Asn)，以Asp→Gly突变比例最高，但不同类型的氨基酸突变不会引起氧氟沙星耐药水平的明显变化^[10]。第90位密码子只有Ser→Ala一种突变类型。在初治患者和已接受过治疗的患者之间，第90位和第94位突变位点的发生频率差异无统计学意义。
目前，我国河南、上海、广州等地结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株QRDR区的突变位点涉及70、74、89、90、91、94位密码子 ，河南省、广州市两地还存在双位点突变现象，突变率分别为63%和3%。与以上地区相比，杭州地区gyrA发生突变的位点单一，未发现与高浓度耐药相关的第70位突变位点和第90、94位双位点突变。Ginsburg等^[2]、Takiff等^[10]曾报道QRDR区中单个密码子的突变往往会导致临床菌株产生较显著的氧氟沙星抗性(MIC>2 μg/ml),而携带2个或多个密码子突变的菌株具有高水平的氧氟沙星耐受性。由此推测杭州地区氧氟沙星耐药株耐受的药物浓度阈值较河南省、广州市低，但还需进一步研究证明。
杭州地区氧氟沙星耐药株第90和94位密码子的总突变率为60.0%，与我国河南、上海、广州等地相比(突变率在73.4%~90.0%之间) ，该突变率较低，可能与本地结核病疫情情况和用药方案有关。本次研究中尚有40.0%的耐药株在QRDR区未检测到与氧氟沙星耐药相关的突变，提示可能还存在细菌细胞壁通透性下降、药物主动外排泵表达、细菌对药物环境的适应性调节、一种新的能与DNA旋转酶结合的蛋白质MfpA等其他耐药机制 。若只采用QRDR区突变位点检测，则无法准确地判断菌株对氧氟沙星的耐受性。对QRDR区未发生突变的耐药菌株进行研究，将有助于揭示氧氟沙星的耐药机制、建立有针对性的检测方法。

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