疾病监测, 2013, 28(7): 583-586
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.7.019
Detection of blaoxa-23 and ISAba1 genes in Acinetobacter baumannii and their relationship with drug resistance
ZHOU Cui, WU Qing, WU Lian-feng, ZOU An-qing, ZHOU Tie-li
Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, Zhejiang, China
Abstract
Objective To understand the current status of drug resistance of Acinetobacter baumannii and the resistance induced by genome blaoxa-23. Methods The susceptibility of 200 strains of A. baumannii to common antibiotics were tested by Kirby-Bauer method, and polymerase chain reaction was conducted to detect carbapenemases-related genome blaoxa-23 and the insertion sequence of ISAba1. Results The resistance rates of cefoperazone/sulbactam, imipenem and polymyxin were relatively low, but the resistant rates to other antibiotics were all above 80%. Among the 200 strains, 155 carried blaoxa-23 gene and 168 carried the insertion sequence of ISAba1. Conclusion The drug resistance of A. baumannii in our hospital was very serious, many A. baumannii strains carried blaoxa-23 gene, which would be responsible for their drug resistance, the insertion sequence of ISAba1 was often associated with the presence of blaoxa-23 gene.
Keywords:    Acinetobacter baumannii   resistance, blaoxa-23   ISAba1  

鲍曼不动杆菌OXA-23基因和ISAba1基因检测和耐药性关系
周翠, 吴庆, 吴莲凤, 邹安庆, 周铁丽
温州医学院附属第一医院 实验诊断中心, 浙江 温州 325000
摘要
目的 了解鲍曼不动杆菌的耐药现状及OXA-23型碳青霉烯酶介导的耐药性。 方法 收集临床分离的200株鲍曼不动杆菌,用K-B(Kirby-Bauer)法进行常见药物的敏感性实验;通过PCR(polymerase chain reaction)扩增、克隆测序等分析OXA-23基因及ISAba1基因。 结果 温州医学院附属第一医院分离的200株鲍曼不动杆菌除对头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、多粘菌素等保持相对较高的敏感性,对其余常见抗生素的耐药率均已超过了80%;200株鲍曼不动杆菌中共检到155株携带OXA-23基因,168株携带ISAba1基因。 结论 温州医学院附属第一医院鲍曼不动杆菌耐药情况严重,大多带有OXA-23基因,该基因编码的碳青霉烯酶应为其耐药的主要原因,ISAba1常伴随OXA-23型出现。
关键词:    鲍曼不动杆菌   耐药性   OXA-23   ISAba1  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 临床菌株
1.1.2 质控菌株
1.1.3 仪器与试剂
1.1.4 引物设计
1.2 方法
1.2.1 药物敏感性实验
1.2.2 模板DNA的制备
1.2.3 OXA-23及ISAba1基因组聚合酶链反应(PCR)扩增
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳
1.2.5 OXA-23和ISAba1基因组扩增产物测序
2 结果
2.1 细菌常见药物敏感性实验结果
2.2 OXA-23和ISAba1基因组扩增结果
2.3 OXA-23及ISAba1基因组PCR扩增产物测序结果
3 讨论
　　鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为条件致病菌，易引起医院感染，根据2006 2007年国内外院内感染监测数据资料显示，鲍曼不动杆菌在院内感染中的检出率居前4位 ，已经成为仅次于铜绿假单胞菌的又一个高致病性非发酵菌，在免疫力低下的患者中，可引起严重的甚至致死性的感染[3]，如呼吸机相关肺炎(ventilator-associated pneumonia，VAP)、脑膜炎、败血症等 。碳青霉烯类抗生素是控制鲍曼不动杆菌感染最有效的药物之一，但随着该类抗生素的长期大量使用，引起耐药菌株不断增多，给临床治疗带来了极大的困难。鲍曼不动杆菌耐药机制十分复杂，其中产碳青霉烯酶是导致该菌耐碳青霉烯类抗生素的主要原因之一。鲍曼不动杆菌产生的碳青霉烯酶主要为OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58型等D类酶；最近研究发现OXA-23、OXA-51基因上游存在插入序列ISAba1，可能与OXA型碳青霉烯酶编码基因的同源重组以及表达调控有关[6]。本文通过对200株鲍曼不动杆菌OXA-23基因及ISAba1功能基因组进行研究及探讨，试了解其耐药机制，为临床治疗及控制耐药株的产生和扩散提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 临床菌株
　　从2008年1月至2011年12月温州医学院附属第一医院住院患者的痰液、尿液、血液等各类标本中分离的鲍曼不动杆菌，每年4月起取50株连续非重复菌株，共4年合计200株，剔除同一个患者同一部位重复分离菌株，细菌的分离培养按照《全国临床检验操作规程》(第3版)[7]进行。
1.1.2 质控菌株
　　质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27583，购自卫生部临床检验中心。
1.1.3 仪器与试剂
　　Eppendorf PCR 5332型扩增仪购自德国艾本德公司；DYY-Ⅲ-8B稳压稳流型电泳仪购自北京六一仪器厂；Gene Genius Bio imaging system紫外凝胶分析系统购自synGene公司；Taq酶、DNA ladder以及其他分子生物学试剂均购自杭州博日生物技术公司；哥伦比亚琼脂、MH琼脂、药敏纸片购自英国Oxoid公司。
1.1.4 引物设计
　　根据GenBank中已经公布的OXA-23及ISAba1全基因组序列，用Oligo6进行引物设计。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物及参考序列见表1。

表1 本文使用的PCR引物及参考序列表
Table 1 PCR primer and reference sequence used in the study
引物名称引物序列预期长度/bp参考序列 (GenBank ID)
OXA-23FTAA TAA ATG AAA CCC CCG AG753FJ959346
OXA-23RATT AAA ACA GCT GAA TAT TATEU827526
ISAba1FCCC TGA TCG GAT TGG AGA AC771GQ861439
ISAba1RATG GGC AAG GCT TTA GAT GCEF127491


1.2 方法
1.2.1 药物敏感性实验
　　采用K-B法进行常见药物的敏感性实验，根据抗菌药物敏感性试验执行标准(2010)(CLSI)进行结果判断。
1.2.2 模板DNA的制备
　　采用煮沸裂解法制备PCR扩增模板：将在血平板上培养过夜的细菌菌落混悬于无菌重蒸馏水，置于100 ℃水浴箱中煮沸10 min使DNA变性，13 000 r/min离心5 min，取上清液5 μl作为反应模板。
1.2.3 OXA-23及ISAba1基因组聚合酶链反应(PCR)扩增
　　PCR反应体系总体积均为25 μl，其中DNA模板5 μl，MgCl21.5 μl，PCR buffer 2.5 μl，dNTPs 0.5 μl，引物应用液0.5 μl，Taq酶0.2 μl，最后ddH2O补充至25 μl；反应参数均为：94 ℃预变性4 min,94 ℃变性1 min,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳
　　PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，120 V，50 min，电泳完毕后置紫外凝胶分析系统中分析检测结果，检测波长为245 nm。
1.2.5 OXA-23和ISAba1基因组扩增产物测序
　　 采用Sanger双脱氧末端终止法进行测序，由上海生工生物工程有限公司完成，并与GenBank注册的相应基因序列进行比对。
2 结果
2.1 细菌常见药物敏感性实验结果
　　200株鲍曼不动杆菌K-B法进行常见药物敏感性实验，结果见表2。表2表明，温州医学院附属第一医院鲍曼不动杆菌的耐药情况十分严重，除了亚胺培南(79.0%)，多粘菌素(2.0%)，头孢哌酮/舒巴坦(68.0%)耐药率在80%以下，其余常见抗生素的耐药率均在80%以上。

表2 200株鲍曼不动杆菌对常见抗菌药物的耐药率
Table 2 Drug resistant rate of 200 A. baumannii strains to common antibiotics
抗菌药物耐药株数耐药率/%抗菌药物耐药株数耐药率/%
多粘菌素42.0氨曲南 19698.0
头孢哌酮/舒巴坦13668.0亚胺培南15879.0
氨苄西林/舒巴坦16884.0庆大霉素16984.5
哌拉西林/他唑巴坦16482.0妥布霉素16984.5
头孢曲松19396.5头孢吡肟17487.0
头孢他啶16582.5呋喃妥因19999.5


2.2 OXA-23和ISAba1基因组扩增结果
　　采用OXA-23及ISAba1特异性引物进行扩增，结果如表3所示，扩增产物电泳图见图1。

表3 200株鲍曼不动杆菌中blaoxa-23和ISAba1基因组检测结果
Table 3 Detection result of blaoxa-23 and ISAba1 gens in 200 A. baumannii strains
基因型 亚胺培南耐药 亚胺培南敏感
株数 构成比/% 株数 构成比/%
OXA-23(+)，ISAba1(+)14371.500.0
OXA-23(+)，ISAba1(－)105.021.0
OXA-23(－)，ISAba1(+)52.52010.0
OXA-23(－)，ISAba1(－)00.02010.0
   合计15879.04221.0


2.3 OXA-23及ISAba1基因组PCR扩增产物测序结果
　　随机选取OXA-23、ISAba1基因组阳性菌株，对其PCR扩增产物进行核苷酸序列分析，测序结果经GenBank网上同源性比较，分别与注册号为JN129846.1及CP003501.1的鲍曼不动杆菌一致，一致性分别为99%和98%。

图1 blaoxa-23和ISAba1基因扩增产物电泳图
Figure 1 Electropherogram of blaoxa-23 and ISAba1 genes PCR products
<i>blaoxa</i>-23和<i>ISAba1</i>基因扩增产物电泳图
注：M：100 bp DNA ladder；1～3：OXA-23(751 bp)；4～6：ISAba1(771 bp)。

3 讨论
　　近年来由于广谱抗生素及免疫抑制剂的广泛使用，许多国家和地区都出现了多重耐药鲍曼不动杆菌(multi-drug resistant Acinetobacter baumannii，MDRAB)和泛耐药鲍曼不动杆菌(pan-drug resistant Acinetobacter baumannii,PDRAB)。郑伟等[8] 1999 2008年对鲍曼不动杆菌对常用抗菌药物的耐药情况进行动态监测，发现10年来鲍曼不动杆菌的分离率与耐药率逐年递增，特别是对亚胺培南的耐药率上升十分迅速；李整社和李瑶[9]、李响新等[10]对鲍曼不动杆菌的耐药趋势研究也得出了相似的结论。本文结果表明(表1)，温州医学院附属第一医院鲍曼不动杆菌耐药情况十分严重，除多粘菌素、亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦等还保持着相对较高的敏感性，其余常见抗菌药物的耐药率均已超过了80%；但鉴于多粘菌素的毒副作用较强，组织渗透性较差，目前临床上较少使用此类药物，而亚胺培南作为碳青霉烯类抗生素的代表药物仍然是治疗鲍曼不动杆菌感染的首选药物。
鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素的耐药机制较为复杂，主要有以下几种：(1)产生水解碳青霉烯类抗生素的水解酶；(2)外膜蛋白(OMP)的减少、缺失或突变；(3)外排泵基因组的启动，减少抗生素在菌体内的浓度；(4)青霉素结合蛋白(PBPs)的改变；(5)整合子等耐药基因转移单元的参与等。其耐药性的表现通常是由其中一种或几种机制共同作用导致[11]，其中产OXA型碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制[12]。温州医学院附属第一医院临床分离的200株鲍曼不动杆菌中OXA-23基因阳性155株，阳性率为77.5%，鉴于该院鲍曼不动杆菌大多带有OXA-23基因，该基因编码的碳青霉烯酶应该是其耐药的一个主要原因。ISAba1基因属于插入序列IS4家族成员，插入序列IS4家族成员常出现于OXA型碳青霉烯酶基因、AmpC基因的上游(或下游)，为其表达提供启动子，其中ISAba1基因常出现于OXA-23、OXA-51基因的上游，而OXA-58基因与ISAba2、ISAba3相关[13]。从表3可以看出，200株鲍曼不动杆菌中同时携带OXA-23基因和ISAba1基因的菌株共143株，且这143株菌株均对亚胺培南耐药；两基因组均未携带菌株共检测到20株，且全部对亚胺培南敏感；本研究中发现了10株耐亚胺培南的OXA-23阳性菌株却未检测到ISAba1基因，我们推测这10株菌OXA-23基因上游的插入序列可能为IS4家族的其他成员,有待进一步的研究探讨；而5株耐亚胺培南菌株仅检测到ISAba1基因，未发现OXA-23基因，我们推测ISAba1后可能携带OXA-58、OXA-51型碳青霉烯酶耐药基因。
综上所述，温州医学院附属第一医院分离的鲍曼不动杆菌耐药情况十分严重，且大多带有OXA-23基因，该基因编码的碳青霉烯酶应该是其耐药的主要原因，插入序列ISAba1常伴随OXA-23出现。

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