Epidemiology and etiology of the first serogroup W135 meningococcal disease case in Hunan
XIA Xin1, DAI De-fang1, ZHAN Zhi-fei1, QIN Di1, ZHANG Hong1, LI Fang-jun1, GAO Li-dong1, ZOU Ming-xiang2
Hunan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Changsha 410005, Hunan, China
Abstract
Objective To understand the epidemiological and etiological characteristics of the first serogroup W135 meningococcal disease case in Hunan province. Methods Blood and cerebrospinal fluid specimens were collected from the suspected meningococcal disease case and throat swabs were collected from healthy people to isolate Neisseria meningitidis. Their identifications were conducted by serogrouping, multi locus sequence typing (MLST) and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The strains' drug susceptibilities were tested. Results Serogroup W135 N. meningitidis was isolated from the cerebrospinal fluid and blood specimens of the suspected cases. Two strains of N. meningitidis W135 were isolated from the throat swabs of healthy people. Three W135 strains were ST-11 genotype, belonging to hyper invasive ST-11/ET-37 complex. All the N. meningitidis W135 strains showed resistance to sulfamethoxazole. Conclusion The first W135 meningococcal disease case was caused by ST-11 type strain, and the ST-11 type N. meningitis W135 were detected in healthy people, so N. meningitidis W135 might circulate in Hunan province.
Keywords:
meningococcal disease
Neisseria meningitidis
pulsed field gel electrophoresis
multi locus sequence typing
湖南省首例W135群流行性脑脊髓膜炎病例流行病学及病原学分析
夏昕1, 戴德芳1, 湛志飞1, 覃迪1, 张红1, 李放军1, 高立冬1, 邹明祥2
1. 湖南省疾病预防控制中心, 湖南 长沙 410005;
2. 中南大学附属湘雅医院
2. 中南大学附属湘雅医院
摘要
目的 了解湖南省首例W135群流行性脑脊髓膜炎(流脑)病例流行病学特征及W135群脑膜炎奈瑟菌的病原学特征。 方法 采集疑似病例的血液和脑脊液标本,采集健康人群咽拭子标本,进行脑膜炎奈瑟菌的培养、分离、鉴定,确定为脑膜炎奈瑟菌。对菌株进行血清学分群和药敏试验;采用多位点序列分型(multi locus sequence typing,MLST)以及脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)方法对菌株进行分子分型。 结果 疑似病例脑脊液及血液中分离培养出W135群脑膜炎奈瑟菌,健康携带者带菌调查咽拭子中分离培养出2株W135群脑膜炎奈瑟菌,均为ST-11型菌株,属于ST-11/ET-37 complex高致病克隆系。3株W135群脑膜炎奈瑟菌对复方磺胺甲恶唑全部耐药。 结论 湖南省首例W135群流脑病例是由ST-11型脑膜炎奈瑟菌引起,健康人群中也出现ST-11型W135型脑膜炎奈瑟菌的携带,W135群流脑在湖南省存在潜在流行的趋势。
内容大纲
-
1 材料与方法
- 1.1 病例及菌株资料
- 1.2 菌株鉴定及血清分群
- 1.3 药敏试验
- 1.4 多位点序列分型(multilocussequencetyping,MLST)试验
- 1.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)试验
- 2.1 生化及血清学分群结果
- 2.2 药敏结果
- 2.3 MLST试验结果
- 2.4 PFGE试验结果
1 材料与方法
1.1 病例及菌株资料 1.1.1 病例流行病学资料
某男性，9岁，湖南省株洲市石峰区学生，于2012年6月12日突发高热、头痛，体温最高达40.6 ℃，在当地医院就诊给予抗感染和对症治疗(具体用药不详)体温下降至正常，患者于6月16日晚再次出现高热达40.2 ℃，并伴有剧烈头痛，喷射性呕吐，相继出现全身皮肤淤点、淤斑，病情加重，在当地进一步诊治后效果不佳，于6月18日上午转到长沙市湘雅医院就诊，入院时患者全身可见散在淤点、淤斑，压之不褪色，咽部充血，可见数个米粒大小出血点，左侧扁桃体肿大，体温39.2 ℃、脉搏108次/分, 呼吸20次/分, 血压104/76 mm Hg，布氏征阳性，克氏征阳性，实验室检查血常规：白细胞总数WBC 10.73×109/L、中性粒细胞比例为83.4%，脑脊液外观混浊、潘氏实验阳性，脑脊液生化：葡萄糖0.18 mmol/L、乳酸脱氢酶271.7 U/L、氯115.1 mmol/L、微量蛋白1.37 g/L、腺苷脱氨酶9.0 U/L，采集患者的血液和脑脊液进行细菌培养，均培养出革兰阴性脑膜炎奈瑟菌，经医院给予头孢他啶等抗感染、降颅压以及对症支持治疗后，患者情况逐渐好转，并于2012年7月5日基本痊愈出院。
1.1.2 菌株资料
W135群流脑菌株共3株，编号HN2012B40为首例W135群流脑病例脑脊液中分离到的菌株，编号HN2012B11-2以及编号 HN2012B11-45为同年4月从湖南省张家界市某中学健康学生咽拭子中分离到的健康人群携带菌株，一并进行病原学分析。
1.2 菌株鉴定及血清分群
将可疑菌落接种到巧克力平皿，5% CO2，37 ℃分纯培养后，取新鲜菌落按说明书接种至API NH生化鉴定试剂卡上，37 ℃孵育2~2.5 h后观察生化结果。血清学实验采用Remel Europe Ltd的脑膜炎奈瑟菌诊断血清，取少量菌落与约50 μl血清在玻片上轻轻研磨混匀，再缓缓晃动玻片约1～3 min后观察结果,先用流脑多价血清进行凝集，再用群因子血清进行凝集分群，同时做生理盐水对照实验。
1.3 药敏试验
采用K-B药敏纸片法和E-test纸条法进行药敏实验，将流脑菌株用生理盐水稀释为0.5麦氏单位浓度后，均匀涂布5％脱纤维羊血MH琼脂，再将K-B纸片或E-test试纸条贴于琼脂表面，置5％CO2，37 ℃培养24 h后，根据CLSI标准判定结果。其中药敏纸片共10种：美罗培南(MEM)、米诺环素(MIN)、头孢曲松(CRO)、头孢噻肟(CTX)、环丙沙星(CIP)、氯霉素(CHL)、阿奇霉素(AZM)、利福平(RIF)、复方磺胺甲恶唑(SXT)、左氧氟沙星(LVX)；E-test检测试纸条共2种：青霉素(PEN)和 氨苄西林(AMP)，均购自英国Oxoid公司。实验质控菌株肺炎链球菌ATCC 49619以及大肠埃希菌ATCC 25922为本实验室留存。
1.4 多位点序列分型(multilocussequencetyping,MLST)试验
多位点序列分型， 参考http://www.mlst.net脑膜炎奈瑟菌MLST分型技术方案，分析脑膜炎奈瑟菌的7个管家基因，把每对管家基因用一对引物进行扩增后，再用相对应的测序引物对每个管家基因在普通PCR扩增后的产物分别进行测序，扩增片段测序完成后，将不同等位基因的序列在MLST数据库中提交，进行检索比对分析，确定菌株的ST型。
1.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)试验
参考PulseNet China中心实验室的脑膜炎奈瑟菌PFGE标准操作方案的方法进行实验(http://www.pulsenet-china.net/)。
2 结果
2.1 生化及血清学分群结果 3株菌均为W135群脑膜炎奈瑟菌。
2.2 药敏结果
所有3株W135群脑膜炎奈瑟菌除对复方磺胺甲恶唑(SXT)耐药外，均对其他9种抗生素均敏感。
2.3 MLST试验结果
对3株流脑菌株菌的7个管家基因片段进行DNA测序，经PubMLST比对后，3株W135群脑膜炎奈瑟菌为ST-11型,属ST-11／ET-37 complex 高致病克隆系。
2.4 PFGE试验结果
湖南省首例W135群病例脑脊液中分离到的W135群菌株(编号为HN2012B40)与2株健康人咽拭子分离的W135群脑膜炎奈瑟菌(编号为HN2012B11-45和HN2012B11-2)分别表现出不同的PFGE带型，相似率为88％。结果见图1。
图1 脑膜炎奈瑟菌PFGE分型结果
Figure 1 Result of PFGE typing of N. meningitidis
3 讨论
流脑是一种高疾病负担疾病， 病死率可达10％以上，10%~15％的幸存者有严重后遗症，严重危害居民的身体健康。我国历史上是A群流脑流行的国家，2003年出现C群流脑的暴发和流行[1]，2006年福建省首先报道了我国第一例W135群流脑病例[2]，随后在广东、广西、安徽等省(自治区)分别报道了W135群流脑感染病例 。近年来，湖南省流脑流行主要以C群为主，
偶有B群流脑散发病例。2012年发现的W135流脑病例为湖南省首例W135群流脑病例。通过MLST序列分型，为ST-11型。目前全球主要流行的侵袭性W135群脑膜炎奈瑟菌均为ST-11型，我国福建、广东、广西、江苏、安徽等省(自治区)发现的W135群流脑病例也均由ST-11型W135型脑膜炎奈瑟菌感染所致。
湖南省W135群侵袭性脑膜炎奈瑟菌以及健康携带者分离的W135群脑膜炎奈瑟菌均为ST-11型。我国健康人群中脑膜炎奈瑟菌携带主要以B群和不可分群菌株为主，中国CDC传染病预防控制所也对2007年以前收集到的7株W135流脑菌株进行了MLST分型[6](均为健康人群监测中分离到W135群菌株)，MLST的分型结果显示为ST-174克隆群和ST-198克隆群，并不属于ST-11／ET-37 的高致病克隆系。湖南省发生W135群流脑病例后，健康人群中检测出ST-11型高致病性脑膜炎奈瑟菌，也提示W135群流脑在湖南省存在潜在流行趋势。
本研究发现3株W135群脑膜炎奈瑟菌均对磺胺类药物耐药，但对其他检测的9种抗生素表现出敏感性，也为临床救治和进行抗生素预防性服药提供了用药依据。
湖南省出现的首例W135群流脑病例对于流脑防控策略的制定和实施提出了新的问题，目前流脑防控主要涉及疫苗的应用，如何制定ACYW135群脑膜炎球菌疫苗的免疫策略，应借鉴其他省市W135群流脑防控的经验。另外，旅行者因素一直是国内外备受关注的流脑流行的主要因素，湖南省是人口流动大省，应进一步加强实验室检测能力，加强流脑病原学监测，密切关注湖南省流脑流行菌群的变迁趋势。
( 志谢： 感谢中国CDC传染病预防控制所呼吸道室的邵祝军、周海健、徐丽、高源、任红宇等老师对本实验的悉心指导和大力支持！)
参考文献
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