疾病监测, 2013, 28(9): 772-774
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.9.020
Detection of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 from a patients with leukemia
WANG Wen-qing1, HUANG Wei-chun2, ZHU Lin-ying1, FU Yi-fei1, SUN Qiao1
Pudong District Center for Disease Control and Prevention of Shanghai, Pudong 200136, Shanghai, China
Abstract
In August 2012, Vibrio cholerae was detected from the blood sample collected from a bacteraemia case, who was a six years old child with recurrent leukemia Medical Center in Pudong district, Shanghai. The biochemical identification, virulence gene detection and drug susceptibility test of the isolate were conducted in Pudong District Center for Disease Control and Prevention. The results indicated that the strain was non toxigenic V. cholerae non-O1 non-O139.
Keywords:    leukemia   bacteraemia   Vibrio cholerae non-O1 non-O139  

1例白血病患者血液中检出非O1非O139群霍乱弧菌
王闻卿1, 黄卫春2, 朱林英1, 傅益飞1, 孙乔1
1. 上海市浦东新区疾病预防控制中心, 上海 浦东 200136;
2. 上海交通大学医学院附属儿童医学中心
摘要
2012年8月,浦东新区儿童医学中心从1名6岁急性淋巴细胞性白血病复发患儿血液中分离到霍乱弧菌,随后浦东新区疾病预防控制中心对该分离株进行了系统生化鉴定、毒力基因及药物敏感性检测,结果为不产霍乱毒素的非O1非O139霍乱弧菌。
关键词:    白血病   菌血症   非O1非O139霍乱弧菌  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 病例资料
1.2 流行病学资料
1.3 实验材料
1.4 细菌分离鉴定方法
1.5 实时荧光定量-聚合酶链反应(real time-PCR)鉴定
1.6 药敏试验方法
2 结果
2.1 细菌分离
2.2 革兰染色镜检
2.3 生化鉴定
2.4 血清凝集(玻片法)
2.5 实时荧光定量-聚合酶链反应
2.6 药敏结果
2.7 治疗及预后
3 讨论
　　霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是一种在水环境中分布广泛的革兰阴性杆菌。根据菌体O抗原的不同，霍乱弧菌可分为139种血清群，常见的能引起大流行的是O1和O139群，其他血清群归为非O1非O139群。O1群与O139群霍乱弧菌是导致人类致命性腹泻的病原体，曾多次引起世界范围内的大流行。非O1非O139群霍乱弧菌引起的菌血症不常见，仅仅发生于免疫功能低下或患有某些基础疾病的患者 。国内报道过肝硬化患者血液中检出非O1非O139群霍乱弧菌 。2012年8月，本实验室对浦东新区儿童医学中心上送的1株白血病患者血培养中分离到的疑似霍乱弧菌进行复核，经革兰染色，系统生化，血清凝集，以及实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，FQ-PCR)检测，确定为非O1非O139群霍乱弧菌。白血病患者血液中检出该菌比较罕见，故予以报道。
1 材料与方法
1.1 病例资料
　　患儿，男，6岁，因急性淋巴细胞性白血病复发，于2012年8月入院治疗。入院时出现乏力，偶有腹痛，腹泻2次/d，精神萎靡，四肢淤斑淤点散在，全腹软，肝肋下质地硬，实验室检查：红细胞2.09×1012/L，白细胞0.8×109/L，中性粒细胞46.7%，血小板4×109/L，血红蛋白63 g/L。
1.2 流行病学资料
　　患儿发病前未接触过海水或河水，也未接触过腹泻患者，家中近期也无人发生腹泻，同时也否认发病前食用生或未烧熟的海产品，居住地附近也未发生过水污染事件。
1.3 实验材料
　　O1群、O139群霍乱弧菌诊断血清由上海市疾病预防控制中心(CDC)提供；霍乱弧菌通用基因、霍乱弧菌O1血清群特异性基因、霍乱弧菌O139血清群特异性基因、霍乱肠毒素基因(ctxAB)基因实时荧光定量-聚合酶链反应试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司；药敏纸片、水解酪蛋白(MH)琼脂干粉购自英国OXOID公司；药敏质控菌株为大肠埃希菌标准菌株(ATCC25922)；全自动血培养仪、全自动微生物鉴定仪(Vitek 2 compact)及鉴定卡片、API20NE手工生化鉴定板条、氧化酶试剂购自法国生物梅里埃公司。
1.4 细菌分离鉴定方法
　　按照《全国临床检验操作规程》(第3版)进行细菌分离，系统生化反应进行菌种鉴定。
1.5  实时荧光定量-聚合酶链反应(real time-PCR)鉴定
　　按照试剂盒说明书提取样本核酸后，放入7500 fast real time-PCR仪中扩增，分别检测霍乱弧菌通用基因、霍乱弧菌O1血清群特异性基因、霍乱弧菌O139血清群特异性基因、霍乱肠毒素基因(ctxAB)，反应条件设置为：50 ℃ 2 min，1个循环；95 ℃ 15 min，1个循环；94 ℃ 15 s→55 ℃ 45 s(收集荧光)，40个循环。
1.6 药敏试验方法
　　采用世界卫生组织(WHO)推荐的纸片扩散法，进行14种抗生素耐药性检测，结果判定采用2010年版美国临床实验室标准化委员会(CLSI)微生物药物敏感性试验执行标准。
2 结果
2.1 细菌分离
　　取患者静脉血，注入血培养瓶后，在全自动血培养仪中进行培养，培养7 h后阳性报警。取样转种血平板、巧克力平板、麦康凯平板，分别置于36 ℃需氧和36 ℃ 5%CO2环境中培养24 h，血平板有湿润，圆整，绿色金属光泽，β溶血菌落生长；麦康凯平板上为光滑，边缘整齐，不发酵乳糖菌落生长，平板上的菌落氧化酶试验均为阳性。
2.2 革兰染色镜检
　　挑取单个菌落进行革兰染色，结果为革兰阴性杆菌。
2.3 生化鉴定
　　分别在平板上挑取多个菌落纯化后，分别采用API20NE手工生化鉴定板条及全自动微生物鉴定仪鉴定，结果均为霍乱弧菌，排除了创伤弧菌感染的可能性。API20NE生化编码为7074745(可信度99.1%，T=1.00)，全自动微生物鉴定仪生化编码0025601150500203(可信度94%)。
2.4 血清凝集(玻片法)
　　分离株与O1群、O139群霍乱弧菌诊断血清均不凝集，根据血清凝集结果判定为非O1非O139群霍乱弧菌。
2.5 实时荧光定量-聚合酶链反应
　　分离株霍乱弧菌通用基因扩增结果为阳性，霍乱弧菌O1血清群特异性基因、霍乱弧菌O139血清群特异性基因、霍乱肠毒素基因(ctxAB)扩增结果均为阴性。试剂盒内部质控对照均成立，见图1。

图1 分离株实时荧光定量-聚合酶链反应结果
Figure 1 Results of FQ-PCR detection of isolate
分离株实时荧光定量-聚合酶链反应结果
  1：待测样本霍乱弧菌通用基因扩增结果； 2~5：分别为霍乱弧菌通用基因、霍乱弧菌O1血清群特异性基因、霍乱弧菌O139血清群特异性基因、霍乱肠毒素基因阳性对照； 6：阴性对照。

2.6 药敏结果
　　分离株对氨苄西林、头孢呋辛、头孢西丁、头孢噻肟、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、萘啶酸、环丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、诺氟沙星、四环素、复方新诺明均敏感。
2.7 治疗及预后
　　血培养阳性后，选用美罗培南，阿米卡星给予治疗。患者症状减轻。再次采集血液进行复查，未培养出细菌；2次采集粪便样本，进行培养霍乱弧菌，也均未检出。
3 讨论
　　O1群和O139群霍乱弧菌是引起世界范围内霍乱流行的病原菌，非O1非O139群霍乱弧菌广泛存在于外环境水、海产品中，通常不产霍乱肠毒素，主要引起伤口感染、菌血症、外耳感染等肠道外感染，以及散发的腹泻 。由非O1非O139群霍乱弧菌引起的菌血症世界各地均有报道，病例年龄在21~64岁之间，感染的季节集中在6 9月，与该季节段气候最适合霍乱弧菌生长有关，并且大都有食用海产品，或者有污染水源暴露史 。本次病例除了患者年龄仅为6岁，与有关报道不同，其发病时间在8月，伴有轻微的腹泻症状，与国内外报道一致 ，但是无食用生或未烧熟海产品的流行病学史，并且也无河水或腹泻患者接触的暴露史，感染途径有待进一步流行病学调查研究。
非O1非O139群霍乱弧菌菌血症死亡率从24.0%~61.5%不等，通常在肝硬化、血液恶性肿瘤等免疫功能低下患者中发生 。该细菌侵入血液的途径、机制尚未阐明，有研究显示，霍乱溶血素可能在疾病的发生过程中起一定作用，使得肠道中的霍乱弧菌通过肠黏膜进入血液[11]。本次病例为白血病患者，白血病会在一定程度上抑制人体免疫系统，大量异常的白血病细胞增生，抑制了正常的具有免疫活性细胞，导致免疫功能低下；另一方面，对白血病的治疗也会同时破坏免疫系统中的正常细胞，从而加重免疫抑制程度，使得细菌更容易突破机体免疫屏障，侵入血液中。血平板分离显示，本次分离株具有β溶血能力。由于患者入院时无明显的腹泻症状，故第一次血培养时，未同时采集粪便样本进行细菌培养，失去了从粪便样本中培养出霍乱弧菌的可能性。我们建议今后如有类似情况，及时采集粪便样本进行细菌培养。
随着分子生物学的快速发展，不断成熟，基于PCR技术的细菌鉴定能够从分子水平进行种属、血清型的分析，具有快速、特异性高等优点，并且很大程度上克服了传统生化反应及血清凝集鉴定中存在的局限性[12]。本次运用血清学联合分子生物学方法进行鉴定，避免了由于血清质量的问题而导致的错误鉴定结果。
非O1非O139群霍乱弧菌对大多数抗生素敏感[8]，本次分离株对选用的14种抗生素均敏感，说明该菌对抗生素耐受性较差，与国内相关报告结果一致 。非O1非O139群霍乱弧菌菌血症是一种危及生命的疾病，主要发生于免疫功能低下的患者，夏秋季为高发季节。故建议此类患者应注意饮食卫生，避免生食或未经烧熟煮透的海鲜食品，并且保证饮水清洁，从而减少潜在的危害因素。
( 志谢： 感谢浦东新区CDC传防科张晓洁老师、浦东新区东方医院检验科张雯雁老师在工作中给予的帮助和支持！)

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