疾病监测, 2013, 28(11): 917-919
DOI: 10.3784/j.issn.1003-9961.2013.11.014
Survey of natural plague focus in Deqin, Yunnan, 2012
DU Chun-hong1, ZHAO Wen-hong1, LIU Zheng-xiang1, LIU Yun-hai2, Tibuzhima3, Zashipinchu3, SONG Zhi-zhong1, GAO Zhi-hou1
Yunnan Provincial Institute for Endemic Disease Prevention and Treatment, Dali 671000, Yunnan, China
Abstract
Objective To make certain whether natural plague focus exists in Deqin county, Yunnan province and provide evidence for the prevention and control of plague. Methods Field survey and laboratory detection were conducted in Deqin from June to July 2012. Specimens were collected to detect plague F1 antigen and antibody by using indirect hemagglutination test (IHA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and colloidal gold immunochromatography assay (GICA) and to isolate Yersinia pestis. Results No Yersinia pestis and F1 antigen were detected in 9 marmot specimens collected. Totally 174 dog serum samples, 9 marmot serum samples, 23 rat serum samples and 853 rat heart infusion samples were used to detect plague F1 antibody. And 2 dog serum samples were positive in IHA, 16 dog serum samples were positive in ELISA and 3 dog serum samples were positive in GICA. Two dog serum samples were positive in all the 3 tests and Western blotting confirmed they had specific chromogenic reaction with plague F1 antigen. Conclusion Plague F1 antibody was detected in dog serums in Deqin, but further study is needed to confirm whether natural plague focus exists in Deqin.
Keywords:    plague   focus   Deqin  

2012年云南省德钦县鼠疫疫源地调查实验室检测结果与分析
杜春红1, 赵文红1, 刘正祥1, 刘云海2, 提布只玛3, 扎史品初3, 宋志忠1, 高子厚1
1. 云南省地方病防治所 云南省鼠疫防控技术重点实验室, 云南 大理 671000;
2. 迪庆州疾病预防控制中心;
3. 德钦县疾病预防控制中心
摘要
目的 调查了解云南省德钦县是否存在鼠疫自然疫源地，为做好鼠疫预防控制工作提供依据。方法 2012年6-7月，应用现场调查和实验室检测结合的方法在德钦县开展鼠疫调查研究工作。对采集的样本采用间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析（GICA）3种方法进行鼠疫F1抗原和F1抗体的实验室检测，对旱獭脏器进行鼠疫菌分离培养。结果 捕获的9只旱獭脏器未分离到鼠疫菌，F1抗原检测均阴性；174份犬血清、9份旱獭血清、23份鼠血清、853份鼠心脏浸液进行F1抗体检测，犬血清IHA阳性2份、ELISA阳性16份、GICA阳性3份，其中2份犬血清3种方法检测均阳性，免疫印迹实验证实，能与F1抗原发生特异性显色反应。结论 德钦县检出鼠疫F1抗体阳性犬血清，需进一步调查证实德钦县是否存在鼠疫自然疫源地。
关键词:    鼠疫   疫源地   德钦  

内容大纲
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源
1.1.2 试剂和设备
1.2 检测方法
1.2.1 细菌分离培养
1.2.2 脏器悬液制备
1.2.3 鼠心脏浸液、血清制备
1.2.4 血清学检测
1.2.5 免疫印迹实验(Western blot)
2 结果
2.1 病原分离培养与F1抗原检测
2.2 鼠疫F1抗体检测
2.3 免疫印迹实验
3 讨论
　　云南省德钦县地处云南省西北部横断山脉地段，青藏高原南延滇、川、藏三省(区)结合部，“三江(怒江、澜沧江、金沙江)并流”腹地。北靠西藏芒康县，西连西藏左贡县、察隅县及云南省怒江州的贡山 县， 南接维西县，东临四川巴塘县、德荣县，总面积为7273 km2。 境内山高坡陡，峡长谷深，地形地貌复杂。按海拔高差划分，地形可分高山河谷区、山区、高寒山区三类。近年，与该县毗邻的澜沧江上游的芒康县、金沙江上游的巴塘县及相邻的德格县都被证实为鼠疫自然疫源地 ，南面的云南丽江玉龙县及古城区也被证实为鼠疫疫源地[4]。为了解该县是否存在鼠疫自然疫源地，开展此次调查研究工作。采集的样本进行了相关实验室检测，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源
　　2012年6月18至7月13日，由云南省地方病防治所、迪庆州疾病预防控制中心(CDC)、德钦县CDC组成30余人的疫源地调查队，对德钦县的4个乡镇，约4500 km2地区，海拔1980～5000 m区间，按照不同海拔梯度，气候带类型，在调查样区内对城镇居民区、农耕地及不同森林植被带等景观中的不同小型兽类及蚤群落栖息生境进行调查取样。同时对调查样区内的指示动物进行血清学检验。采用圈套法、吊杆扣等方法，捕获喜马拉雅旱獭9只，采自叶日牙荣、叶日鲁咱、察永坝、毕通、加椎卡5个牧场；野外采用鼠夹5 m夹线法、居民区采用笼夜法，共捕获小型哺乳动物897只，获心脏浸液853份，鼠血清23份，采自白茫雪山东坡和西坡两个调查区域内的居民区、农耕地及不同森林植被带；采用真空采血器采集犬股动脉/静脉血174份，采自德钦县升平镇、燕门乡、云岭乡、佛山乡的19个自然村。
1.1.2 试剂和设备
　　鼠疫F1抗原、F1抗体检测间接血凝试剂盒(indirect hemagglutination assay, IHA)由吉林博德医学免疫制品有限公司生产，批号：20111215；双抗体(抗原)夹心酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒由兰州生物制品研究所有限责任公司提供，批号：20111202、20120102；胶体金免疫层析试纸条(gold immunochromatography assay, GICA)由云南省地方病防治所自制，批号：20110401,201201。赫氏培养基由北京陆桥公司生产。设备：酶标检测仪Anthos 2010型，自动洗板机BIO-RAD 1575型，电转印转膜系统BIO-RAD Trans Blot SD，电泳仪BIO-RAD Mini PROTEAN Tetra Cell。
1.2 检测方法
1.2.1 细菌分离培养
　　无菌条件下解剖旱獭(鼠标本因未发现自死鼠，未进行细菌分离培养)，取心、肺、肝、脾、腺切面直接点种平皿，每只旱獭脏器共分区接种1个平皿，划线28 ℃培养，连续观察3天，每天记录，无可疑鼠疫菌生长即为阴性。
1.2.2 脏器悬液制备
　　取旱獭肝、脾组织约1 g，加升汞盐水1.0 ml研磨，制成1 ∶ 10悬液，1000 r/min离心5 min，取上清备检。
1.2.3 鼠心脏浸液、血清制备
　　死鼠按常规方法解剖，取心脏组织剪碎后加入500 μl生理盐水，4 ℃冰箱过夜。活鼠腹股沟采血。
1.2.4  血清学检测
　　血液、心脏浸液离心分离血清、上清，56 ℃灭活30 min后，采用IHA微量法、双抗原 夹心ELISA和GICA 法检测鼠疫F1抗体(心脏浸液 未做GICA检测)；脏器悬液标本采用 反向间接血球凝集试验(RIHA)、双抗体夹心ELISA和GICA法检测F1抗原。方法按试剂盒说明书进行。IHA初筛实验阳性者做复判实验，当抑制列抑制2孔以上、对照阴性、凝集效价≥1 ∶ 16时，判定为阳性；ELISA初筛阳性者作确证实验，当抑制列抑制2孔以上，被检测孔A值≥阴性对照孔的2.1倍时(阴性孔A值<0.1者，以0.1计)的最高稀释度作为血清的效价终点；GICA检测时，10 min内质控线和检测线均出现紫红色带判定为阳性。
1.2.5 免疫印迹实验(Western blot)
　　将天然F1蛋白和重组F1蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳后，电转到PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，TBS漂洗PVDF膜，加入待检血清，4 ℃孵育过夜，再以TBS漂洗4次，加入HRP-SPA(辣根过氧化物酶标记SPA)37 ℃孵育2 h。用TBS洗涤后， 二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)显色。
2 结果
2.1 病原分离培养与F1抗原检测
　　对9份旱獭脏器进行鼠疫细菌学与F1抗原检测，结果均为阴性。
2.2 鼠疫F1抗体检测
　　应用IHA、ELISA、GICA三种方法共检测各种动物血清206份，其中旱獭血清9份、犬血清174份、鼠血清23份；IHA、ELISA两种方法检测小型哺乳类动物心脏浸液853份,结果见表1。

表1 2012年德钦县鼠疫F1抗体检测结果
Table 1 Detection result of plague F1 antibody in Deqin, 2012
样本名称 数量 IHA ELISA GICA
阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性
旱獭血清9090909
犬血清1742172151592172
鼠血清23023122122
心脏浸液85308530853--
合计1059210571610433203


其中3种检测方法均阳性的有2份犬血清，2种方法阳性鼠血清1份，多份样品ELISA阳性，但滴度均较低，见表2

表2 阳性样品检测结果
Table 2 Detection result of positive samples
样品名称样品编号IHAELISAGICA
犬血清761 ∶ 801 ∶ 256+ +
犬血清1511 ∶ 801 ∶ 1024+ + +
犬血清28，78，171-1 ∶ 32-
犬血清60,168-1 ∶ 16-
犬血清48,49,85,127,139,140-1 ∶ 8-
犬血清95,145-1 ∶ 4-
鼠血清849-1 ∶ 16+ +


2.3 免疫印迹实验
　　综合考虑上述检测结果和血清剩余量，对3种方法检测均阳性的2份犬血清进行免疫印迹实验。结果表明，2份血清样品与天然F1、重组F1抗原均发生特异性结合反应(天然F1抗原相对分子质量Mr为15.5×103，重组F1抗原相对分子质量为35.5×103),结果见图1。

图1 2份犬血清与鼠疫F1抗原的免疫印迹实验检测结果
Figure 1 Result of Western blotting for F1 antigen in 2 dog serum samples
2份犬血清与鼠疫F1抗原的免疫印迹实验检测结果
  M：蛋白Marker； 1：76号血清与重组F1抗原的反应；2：76号血清与天然F1抗原的反应； 3：151号血清与重组F1抗原的反应； 4：151号血清与天然F1抗原的反应
3 讨论
　　犬作为重要的指示动物，在发现鼠疫自然疫源地、确定其范围、掌握流行动态等方面，具有重要意义[5]。该县检出F1抗体阳性犬血清，提示需进一步进行相关调查。
IHA微量法是鼠疫免疫学检验的常规方法，ELISA、GICA试验近年来也得到越来越广泛的应用。3种方法敏感性和特异性各有优点。本次调查采用3种方法检测样品，并对2份F1抗体阳性样品以免疫印迹法进行验证，图1结果表明血清中抗体能与鼠疫F1抗原发生特异性结合，排除非特异性反应的可能。IHA、ELISA、GICA血清抗体阳性率分别是0.97%(2/206)、7.77%(16/206)、1.46%(3/206)。3种方法中，ELISA敏感性最高，但滴度≤1 ∶ 32的13份犬血清IHA、GICA均阴性，849号鼠血清IHA阴性。因此，在实际工作中，多种方法同时应用，可相互参照，最大限度地避免阳性漏诊。
本次调查中野外均用夹线法捕获小型哺乳动物，捕获动物已死亡，无法获得血清标本。根据雷刚等[6]的研究，鼠心血冲洗液F1抗体阳性检出率与血清比较无差异。 因此，为获得更多调查数据， 收集了853份小型哺乳动物心脏冲洗液进行IHA、ELISA检测，结果均为阴性。
本次调查按照不同海拔梯度，气候带类型，在白茫雪山东坡和西坡两个区域内，对城镇居民区、农耕地及不同森林植被带3类主要生态环境中的小型哺乳动物进行调查取样；在4 个乡镇19个自然村、5个牧场、4个居民区采集犬血清、鼠血清、旱獭血清及脏器进行检测。结果表明，该地存在鼠疫F1抗体阳性指示动物，经相应流行病学调查和随访，2只阳性犬均为流浪犬被收养，不能明确其真实来源。1份ELISA低滴度阳性鼠血清采自海拔2300 m的明永居民区的大足鼠，当日在此区域共捕获小型哺乳动物33只，包括社鼠、齐氏姬鼠、大足鼠、中华姬鼠、大耳姬鼠、藏鼠兔等，但该血清抗体滴度较低、IHA检测阴性，需进一步调查研究。
( 志谢： 对参加本次调查工作的所有同志表示感谢！)

参考文献
[1] Liu G, Jiang ZY, Zaxi, et al. Plague detection in Tibet autonomous region [J]. Chinese Journal of Control of Endemic Diseases,2008,23(Plague supplement):82-84. (in Chinese) 刘刚,蒋志勇,扎西,等. 西藏自治区2007年鼠疫检测结果[J]. 中国地方病防治杂志,2008,23(鼠疫监测增刊):82-84.
[2] Wang LM,Qi T,Yang J,et al.Batang county was confirmed as another plague foci county in Sichuan province[J]. Journal of Preventive Medicine Information,2012,28(10):786-788.(in Chinese) 汪立茂,祁腾,杨军,等.巴塘县为四川省又一旱獭鼠疫疫源县[J]. 预防医学情报杂志,2012,28(10):786-788.
[3] Liu Y, Louzhi DB, Wang LM, et al. Survey of plague natural focus in Dege [J]. Preventive Medicine Information Journal,2010,26(1):1-3.(in Chinese) 刘谊,罗志丹巴,汪立茂,等. 2008年德格县鼠疫自然疫源地实验检测结果分析[J]. 预防医学情报杂志,2010,26(1):1-3.
[4] Song ZZ,Xia LX,Liang Y,et al.Confirmation and study of plague natural foci for Yulong county and Guchengqu in Yunnan province[J]. Chinese Journal of Control of Endemic Diseases,2008,23(1):3-7. (in Chinese) 宋志忠,夏连续,梁云,等. 云南玉龙及古城区鼠疫自然疫源地判定及初步研究[J]. 中国地方病防治杂志,2008,23(1):3-7.
[5] Liang JM,Yang JY.Progress in the research of indicator animals of plague in China[J]. China Tropical Medicine,2004,4(4):676-677. (in Chinese) 梁江明,杨进业. 我国鼠疫指示动物研究进展[J]. 中国热带医学,2004,4(4):676-677.
[6] Lei G,Lyu TY,Tang JG,et al. Detection of F1 antibody against Yersinia pestis in flushing fluid of heart blood of Rhombomys opimus with ELISA: a feasibility study[J]. Chinese Journal of Endemiology,2011,30(1):36-38. (in Chinese) 雷刚,吕天义,唐建国,等. 酶联免疫吸附试验检测大沙鼠心血冲洗液中鼠疫F1抗体的可行性分析[J].中国地方病学杂志,2011,30(1):36-38.