进行性多灶性脑白质病是一种致死性中枢神经系统脱髓鞘疾病，多瘤病毒(John Cunningham virus，JCV)感染是其病因^[1]。JCV属于多瘤病毒科(polyomaviridae)，为无包膜双链DNA病毒，其病毒颗粒直径40~50 nm，由72个VP1五聚体及少量VP2或VP3组成病毒衣壳 ^[1]。JCV感染多发生于青少年时期，常不引起明显症状^[2]。长期以来，医学界对JCV的认识主要局限在JCV与进行性多灶性脑白质病的相关性上，这个时期进行性多灶性脑白质病是相当罕见的疾病，主要发生于免疫功能低下的患者^[2]。随着艾滋病的蔓延，进行性多灶性脑白质病逐渐成为发展中国家艾滋病患者中的常见并发症之一，大约5%的艾滋病患者会并发进行性多灶性脑白质病，引起了更多医生与研究人员的关注^[3]。近年来，JCV感染与人类神经系统肿瘤及消化系统肿瘤的相关性也被越来越多地报道 ^[3]。
世界各地的流行病学数据显示JCV DNA检出率为26%～85%不等，抗JCV抗体阳性率为8.0%～84.2%不等，说明该病毒在世界范围内广泛流行^[2]。国外已有多种JCV DNA与抗JCV抗体检测方法，国内也有部分文献报道JCV DNA检测数据，但国内JCV血清学检测技术还是空白。因此，本研究通过大肠埃希菌表达系统制备JCV病毒样颗粒并建立JCV血清学检测技术，具有重要意义。 1.1 菌种、载体和主要试剂
　　PET-21a购自美国Merck公司， BL21(DE3)、TransGen ProteinRuler Ⅳ、TransGen Blue Plus Protein Marker购自北京全式金生物技术有限公司。DL2000 DNA Marker， λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Marker、DH5α感受态细胞、Ex-Taq酶、PMD18-T载体购自大连TaKaRa公司。胶回收试剂盒QIAEXII Gel Extraction Kit购自德国QIAGEN公司。限制性内切酶(NdeⅠ、XhoⅠ)购自美国NEB公司。T4连接酶购自美国Invitrogen公司。鼠多克隆抗体NCL-JCBK购自美国Abcam公司。ELISA使用的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体、TMB显色液、终止液均购自北京万泰生物股份有限公司。JCV标准株Mad-1的VP1序列(GenBank Accession No. J02226)由北京天一辉远生物技术有限公司合成，合成的JCVP1序列连接在PSE380载体上，命名为PSE380-JCVP1。
1.2 调查对象
　　收集浙江大学医学院附属第一医院体检中心299份成人血清，年龄为19~77岁，入选标准：排除先天与获得性免疫缺陷疾病、抗病毒治疗、免疫抑制剂治疗、各型肝炎感染及妊娠状态。
1.3 目的片段的扩增
　　以PSE380-JCVP1为模板，设计引物，上游引物(JCVP1 F)与下游引物 (JCVP1 R)的5′端分别添加NdeⅠ与XhoⅠ酶切位点，扩增产物的理论长度为1080 bp。
JCVP1 F：CAC AAG CTT TTT TGG GAC ACT AAC AGG AGG；JCVP1 R：GAT TCT GCA GCA GAA GAC TCT GGA CAT GG。反应条件为94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 10 s,扩增30个循环。用胶回收试剂盒回收PCR产物后与PMD18-T连接，命名为PMD-JCVP1，对VP1部分序列进行测序(美国Invitrogen公司)。
1.4 表达载体的构建
　　使用NdeⅠ、XhoⅠ双酶切质粒PMD-JCVP1，获得含VP1基因的片段(1080 bp)连接至由相同酶切的pET-21a质粒的多克隆位点，得到质粒pET-JCVP1，将质粒送公司测序，以验证序列及开放阅读框是否正确。
1.5  目的蛋白的表达
　　将pET-JCVP1质粒转化BL21 (DE3)感受态细胞，挑取单克隆于2 ml LB(含氨苄西林50 μg/ml)，37 ℃，210 r/min培养至A₆₀₀达到0.6时，加入终浓度1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达4 h。以未加IPTG诱导的菌液为阴性对照，12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。
1.6 JCV病毒样颗粒的制备及鉴定
　　为了增加JCVP1蛋白的可溶性表达，通过参考相关文献，摸索了最佳表达条件^[4]。以终浓度0.1 mmol/L IPTG 在30 ℃下诱导表达4 h，进行目的蛋白的大量表达，4000 r/min收集菌液沉淀，菌体置冰上超声裂解，收集上清。上清转移至铺有蔗糖(40%，W/W；PBS配制)垫层的离心管中，于4 ℃、34 000 r/min(SW41 Ti转子 美国Beckman公司)离心3 h。超速离心后的沉淀用PBS重悬，然后使用非连续CsCl梯度(1.25、1.35、1.50 g/ml；PBS配制)于4 ℃、34 000 r/min离心6 h。收集超速离心后纯化样品，并在PBS中透析3次，经12.5% SDS-PAGE分析。并使用磷钨酸负染，于透射电子显微镜下观察。在96孔板中，将50 μl的纯化样品与50 μl的PBS(含0.2% BSA)倍比稀释，以未转化pET-JCVP1质粒的大肠埃希菌裂解液及PBS为对照，37 ℃孵育1 h后，加入50 μl 0.5%人“O”型红细胞悬液，4 ℃静置3 h后观察血凝结果^[5]。
1.7 建立JCV血清学检测方法及临床标本筛查
　　 以超速离心纯化后的JCV病毒样颗粒为抗原，建立间接ELISA法，筛查299份一般人群血清，具体过程如下：①包被：用包被液(50 mmol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6)1 ∶ 25稀释抗原，每孔包被100 μl，包被96孔酶标板，37 ℃ 2 h。PBS-T洗涤3次。②封闭：每孔加入100 μl封闭液(5%脱脂牛奶，0.05% Tween 20，PBS配制)，37 ℃ 1 h。PBS-T洗涤3次。③加样品：每孔加入90 μl封闭液，然后加入10 μl血清，37 ℃ 1 h。PBS-T洗涤5次。④加HRP标记羊抗人IgG抗体：每孔加入100 μl HRP标记羊抗人IgG抗体，37 ℃ 30 min。PBS-T洗涤5次。⑤显色：每孔加入TMB显色液100 μl，室温反应10 min。⑥测定：加入50 μl 终止液终止反应，双波长(A450/630 nm )检测吸光度(A)。通过参考相关文献^[5]，通过棋盘法摸索了抗原及血清稀释度，最终确立1 ∶ 25为抗原稀释度、血清稀释度为1 ∶ 10。同时设立阳性对照1孔(以鼠多克隆抗体NCL-JCBK为样品)；阴性对照10孔(以1岁以下儿童血清作为样品，儿童血清由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤室惠赠)；空白对照(不加样品与HRP标记羊抗人IgG抗体，其他步骤相同)。结果判断：临界值(Cut-off)=阴性对照吸光度值平均值+3倍标准差(M+3s)；阳性判定：样品吸光度≥Cut-off者为抗JCV抗体阳性；阴性判定：样品A值

2 结果

2.1 PET-JCVP1表达质粒的构建
　　图1显示，重组质粒pET-JCVP1经过NdeⅠ与XhoⅠ双酶切后，得到约5400 bp的pET-21a载体和约1080 bp的JCV VP1基因片段，与预期大小一致，DNA测序结果也证明VP1序列及开放阅读框架正确。

图1 JCV VP1基因表达质粒的酶切鉴定结果
Figure 1 Enzyme identification of expression plasmid of VP1 gene of JCV

2.2  JCV VP1蛋白的表达
　　图2所示，经SDS-PAGE鉴定，诱导后的菌液有大量的JCV VP1蛋白表达，蛋白分子质量大小为40×10³，与预期大小一致。

图2 VP1蛋白的原核诱导表达SDS-PAGE分析
Figure 2 SDS-PAGE analysis of expression of VP1 protein by prokaryotic induction

  C：未诱导的菌液；M：TransGen ProteinRuler Ⅳ Protein Marker； 1： 1mmol/L IPTG诱导表达的菌液

2.3 JCV病毒样颗粒的制备及鉴定
　　将JCV VP1蛋白大量表达后，超声裂解表达菌，离心除去细胞碎片，上清经过蔗糖超速离心后，管底有沉淀聚集。使用PBS重悬沉淀，将初次超速离心后的样品经非连续CsCl密度梯度超速离心，结果显示在 1.25 g/ml与1.35 g/ml层之间有蛋白条带分布，收集该蛋 白条带后，使用SDS-PAGE鉴定、负染后电镜观察及血凝试验鉴定。① 图3所示，纯化后的JCV VP1蛋白条带单一，与预期大小一致。② 图4所示，

图3 SDS-PAGE分析超速离心纯化的VP1产物
Figure 3 Purified product of ultracentrifugation analyzed with SDS-PAGE

  M：TransGen Blue Plus Protein Marker； 1： 0.1 mmol/L IPTG诱导表达的菌液； 2： JCV病毒样颗粒纯化样品

通过透射电子显微镜观察，可见JCV病毒样颗粒为40～50 nm的正二十面体病毒，与天然的JCV病毒颗粒的典型形态相符。③ 血凝试验中，PBS及未转化PET-JCVP1的大肠埃希菌裂解液均没有血凝，表1显示，JCV病毒样颗粒的血凝滴度为1/256。

表1 JCV病毒样颗粒的血凝试验分析
Table 1 Hemagglutination assay of JCV-like particles

血凝试验	稀释度
	1	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256	1/512	1/1024
JCV VLP	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-	-

图4 JCV VP1病毒样颗粒电镜观察结果
Figure 4 Result of transmission electron microscopy of JCV-like particles

2.4 ELISA法筛查人群JCV感染情况
　　通过建立以JCV病毒样颗粒为抗原的间接ELISA法，检测了299份浙江地区19～70岁一般人群血清样品， Cut-off值为0.33(M+3s)。表2显示，该人群中抗JCV IgG抗体阳性率为54.2%，年龄在17～30岁之间的人群抗JCV IgG抗体阳性率稍低，为39.1%，年龄在30～77岁之间的人群抗JCV IgG抗体阳性率为52.0%~60.7%。

表2 浙江地区19～70岁健康人群JCV血清学检测结果
Table 2 Seroepidemiology of JCV in healthy population aged 19-70 years in Zhejiang

年龄组(岁)	标本数	男性	女性	阳性数	阳性率/%
<30	23	14	9	9	39.1
30~	75	40	35	39	52.0
40~	101	78	23	55	54.4
50~	44	34	10	25	56.8
≥60	56	47	9	34	60.7
合计	299	213	86	162	54.2

3 讨论

　　病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，无病毒的核酸，不能自主复制，在形态上与天然的病毒颗粒相同或相似。VLPs保留了天然病毒颗粒大部分的中和表位，具有高度的免疫原性，能有效地结合构象型抗体，是用于血清抗体检测的理想抗原 。多篇文献通过杆状病毒昆虫细胞表达系统、酵母表达系统以及大肠埃希菌表达系统，仅表达JCV VP1蛋白且无需VP2、VP3蛋白的参与，即可在宿主表达细胞内组装成与天然JCV相似的VLPs^[6]。
本研究通过快速、简便的大肠埃希菌表达系统，在30 ℃下，以0.1 mmol/L IPTG条件下诱导表达4 h， 得到了高表达量的VP1蛋白。经超速离心的方法 纯化了JCV VLPs，通过SDS-PAGE鉴定，纯化的VLPs为单一的条带，说明纯化产物纯度较高。通过透射电子显微镜观察，显示VLPs具有和天然JCV颗粒类似的40～50 nm正二十面体结构。而后的血凝试验进一步证明我们获得的VLPs具有1/256的血凝滴度。上述结果证明JCV病毒样颗粒具有和天然的JCV颗粒类似的形态结构和血凝活性。
通过以纯化的JCV病毒样颗粒为抗原建立了ELISA法，对299份一般人群血清标本进行了抗JCV IgG抗体检测，检测结果表明抗JCV IgG抗体阳性率为54.2%，与瑞士一篇文献报道(抗JCV IgG抗体阳性率59%)相似^[7]，表明JCV在我国一般人群中普遍流行。目前，随着艾滋病患者的逐年增多，进行性多灶性脑白质病患者也逐渐增多，该病是一种严重的致死性疾病，严重影响艾滋病患者的生存质量，而JCV正是导致进行性多灶性脑白质病的病原体；此外JCV感染与神经系统肿瘤及消化系统肿瘤等疾病也具有一定的相关性。而国内对JCV的研究甚少，因此我国人群中高JCV感染率应当引起相关临床工作者及疾病预防控制单位的重视。
本研究通过大肠埃希菌表达系统制备JCV病毒样颗粒，为进一步研究VP1蛋白及JCV病毒样颗粒生物功能、JCV抗体的制备奠定基础；基于JCV病毒样颗粒建立的血清学检测方法可初步应用于JCV的血清学筛查。

参考文献

[1] Moore PS, Chang Y. Why do viruses cause cancer? Highlights of the first century of human tumour virology[J]. Nat Rev Cancer,2010,10(12):878-889.
[2] Knowles WA. Discovery and epidemiology of the human polyomavirus BK virus (BKV) and JC virus (JCV)[J]. Adv Exp Med Biol,2006,57,7:19-45.
[3] Brew BJ, Davies NW, Cinque P, et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy and other forms of JC virus disease[J]. Nat Rev Neurol,2010,6(12):667-679.
[4] Bertolotti-Ciarlet A, White LJ, Chen R, et al. Structural requirements for the assembly of Norwalk virus-like particles[J]. J Virol,2002,76(8):4044-4055.
[5] Suzuki S, Sawa H, Komagome R, et al. Broad distribution of the JC virus receptor contrasts with a marked cellular restriction of virus replication[J]. Virology,2001,286(1):100-112.
[6] Ou WC, Wang M, Fung CY, et al. The major capsid protein, VP1, of human JC virus expressed in Escheichia coli is able to self-assem ble into a capsid-like particle and deliver exogenous DNA into human kidney cells[J]. J Gen Virol,1999, 80(1):39-46.
[7] Egli A, Infanti L, Dumoulin A, et al. Prevalence of polyomavirus BK and JC infection and replication in 400 healthy blood donors[J]. J Infect Dis,2009,199(15):837-846.

	扩展功能
	本文信息
	PDF全文
	HTML全文
	参考文献
	服务与反馈
	把本文推荐给朋友
	加入我的书架
	加入引用管理器
	引用本文
	Email Alert
	本文作者相关文章
	赵洪兰
	刘熙君
	徐承富
	王岳
	江永珍
	宋敬东
	毕胜利
	PubMed
	Article by ZHAO Hong-lan
	Article by LIU Xi-jun
	Article by XU Cheng-fu
	Article by WANG Yue
	Article by JIANG Yong-zhen
	Article by SONG Jing-dong
	Article by BI Sheng-li