人类诺如病毒(Noroviruses，NoV)又称诺瓦克样病毒(Norwalk-like viruses)，是杯状病毒家族主要成员，为单股正链RNA病毒。NoV是引起急性流行性胃肠炎的常见致病原^[1]。有报道称，在美国超过42%的非细菌性胃肠炎暴发都是由NoV引起的^[2]。由于NoV容易突变，存在多种抗原的类型和基因型，NoV抗原的多样性使其利于逃避机体免疫而适应生存。因为没有敏感细胞和动物模型，所以严重阻碍了对诺如病毒的研究。目前对NoV的诊断方法主要是免疫电镜法(IEM)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫试验(ELISA法)、 实时荧光定量-聚合酶链反应(real time-PCR)等^[3]， 其中，用单克隆抗体(mono-clonal antibody，McAb)捕捉粪便中的病毒抗原是目前杯状病毒免疫学检测的主要方法。单克隆抗体具有交叉反应小，灵敏度高，特异性强的特点，在许多疾病的诊断中已得到广泛应用。目前我国对杯状病毒免疫检测方法的研究仅有少数报道^[4-5] ，制约了NoV快速检测和疾病控制工作的开展。浙江省湖州地区由NoV引起的食物中毒经常发生，因此需建立一个快速检测NoV的方法。本研究以E. coli表达的GⅡ型湖州株NoV衣壳蛋白(VP1)作为免疫原，免疫BALB/c小鼠并制备单克隆抗体(mAb)，用已知表位序列多肽筛选mAb，并与天然标本反应验证，为研制NoV快速检测试剂盒奠定基础。

NoV粪便标本为湖州市一次腹泻暴发疫情中采集到的，经real time-PCR检测为阳性的标本。BALB/c小鼠，雌性，8～12周龄，体重16～19 g，SPF环境饲养，由浙江省疾病预防控制中心提供。小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0由本实验室保存培养。NoV VP1蛋白基因的克隆、表达和鉴定方法见文献报道^[6]，NoV VP1蛋白表达重组质粒pET28a(+)-Noro-VP1由本实验室制备及保存。PEG-MW3350购自Sigma公司，HAT、HT和RPMI 1640购自Gibco公司，新生牛血清购自杭州四季青公司，羊抗鼠IgG购自Abmart公司。其他试剂均为国产分析纯。

用Modeller9.9(http://www.salilab.org/modeller/9.9/release.html ^[7])为NoV GⅡ型湖州株VP1蛋白构建三维模型，构建好的三维模型提交到SEPPA(Spatial Epitope Prediction of Protein Antigens)(http://lifecenter.sgst.cn/seppa/index.php)在线B-cell 空间表位预测软件，对GⅡ型湖州株VP1蛋白进行空间表位预测。

用纯化后的NoV VP1蛋白作为免疫原免疫8～12周的雌性BALB/c健康小鼠9只，每次免疫剂量为100 μg/只，免疫途径为腹腔免疫，每次免疫间隔2周，首次免疫使用弗氏完全佐剂，抗原与弗氏完全佐剂按质量比1 ∶ 1混合乳化。后2次免疫采用抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化；第3次免疫完成10 天后小鼠尾部取血检测免疫效果，血清效价达到10⁴后可脾内注射进行加强免疫，3天后取脾融合。

取免疫后小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规融合方法融合。融合后细胞用含HAT的RPMI 1640培养液进行筛选。融合后的细胞经过适当稀释，分置于3×384孔培养板中培养，培养10～14天进行ELISA检测。用预测的表位序列来筛选阳性克隆，得到对应这些表位的单克隆抗体。挑选光密度(A)值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。此过程重复数次，直至阳性孔比率为100%，我们即认为此为单克隆。将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1～2×10⁶ /管进行冻存。同时收集细胞进行腹水制备。

每只BALB/c小鼠腹腔注射石蜡500 μl，4天后腹腔接种杂交瘤细胞1×10⁶个/只，7~10 天后可产生腹水。收集腹水，3000×g离心10 min去除细胞碎片等沉淀。用重组蛋白(0.25 μg/ml)作为抗原包板，腹水从10^-3起2倍稀释至1 ∶ 64 000作为一抗(连续梯度稀释)，羊抗鼠IgG作为二抗，对培养7天的融合细胞上清进行间接ELISA检测。一抗倍比稀释后每孔100 μl，37 ℃孵育1 h；二抗为1 ∶ 2 000羊抗鼠IgG-HRP(1 mg/ml)，5%PBS脱脂奶粉稀释，100 μl/孔，37 ℃孵育1 h；显色液为ABTS ，37 ℃避光反应15 min。检测每孔吸光度A₄₅₀值，大于阴性对照两倍的吸光度值判为阳性。

用Western blot方法测定mAb对GⅡ型湖州株NoV VP1重组蛋白，及对天然GⅡ型NoV粪便标本的特异性反应情况。

我们从PDB下载了NoV衣壳蛋白VP1的三维结构作为Modeller建模的模型，为GⅡ型湖州株VP1蛋白构建了三维模型，将构建好的三维模型提交到在线SEPPA预测后得到15段可能的表位序列，见表1。合成这些肽段用于单克隆抗体的筛选。

重组质粒pET28a(+)-Noro-VP1电泳后大小符合，测序正确(图1)，成功构建获得重组表达载体。将诱导表达产物进行SDS-PAGE分析，结果显示在诱导6 h后有一明显条 带。可溶性分析显示此蛋白为包涵体，包涵体经尿素，Ni²⁺柱亲和纯化后，经SDS-PAGE检测(图2)，表明目的蛋白得到纯化，目的表达蛋白占总蛋白的95%以上，其纯度可以满足动物免疫试验需要。

用15条已知表位序列多肽(0.25 μg/ml)分别包被酶标板来筛选单克隆抗体，PC孔包被His-BSA做阳性对照，检测孔和NC孔均包被多肽-BSA。Elisa Titer判断标准：大于NC(NC：免疫抗原包板，检测抗体为牛奶+细胞培养基)两倍且>0.25的A₄₅₀值对应的稀释度值即为该抗体的效价。对抗体分泌能力强的培养孔用有限稀释法进行2次克隆化，共筛选出10株能稳定分泌抗NoV核衣壳蛋白抗体的细胞株，分别命名为2C15、1E8、1P10、2L16、1L22、2K10、1K16、8J12、6I2、8O10。这些筛选到的单克隆抗体对应两条多肽表位，1L22、1E8、1P10和1K16对应编号2的表位，2L16、2C15、2K10、8J12、6I2和8O10对应编号为5的表位。

收集腹水，用间接ELISA方法测定，用重组蛋白(0.25 μg/ml)包被酶标板。结果显示1E8、1P10、2C15和2L16四株抗体最强，腹水稀释至10^-6P/N值为0.5；2K10、1K16、8J12、6I2株抗体较弱，腹水稀释至10^-4P/N值为0.4左右；1L22和8O10两株抗体最弱，腹水稀释至10^-3P/N值为0.2左右(阴性对照P/N值为0.08)。同时对10株细胞株进行Western blotting验证，结果显示2K10，1K16，1E8与重组蛋白能很好的结合(图3)。综合以上结果，选择细胞株1E8进行扩大培养并初步应用。

mAb 1E8扩大培养后分别与表达重组蛋白和诺如粪便标本进行Western blotting检测，结果显示mAb不仅可以同表达重组蛋白进行特异性反应，并且可以同天然NoV核衣壳蛋白进行特异性反应(图4)。

3 讨论

NoV最早发现于1972年，由Kapikian等^[8]借助免疫电镜技术(IEM)观察到一种病毒颗粒，并根据发病地区将此病毒命名为Norwalk virus(NoV)。NoV作为流行性肠胃炎的主要病因之一，无论在发展中国家还是发达国家，从儿童到成年人都可以受到NoV的感染并造成暴发流行，成为影响人类健康不可忽视的问题。据统计，在美国，成人非细菌性胃肠炎的暴发中有42%由该类病毒所引起。人类NoV分为GⅠ和GⅡ两组^[9-10] 。根据我国的调查结果^[11-13] ，认为GⅡ组NoV为我国主要流行组，因而本实验也采用GⅡ组NoV作为研究对象。

NoV是单股正链RNA病毒，其基因组长度为7~7.5 kb，包括3个ORF，其中ORF2编码一个Mr为58~65×10³的病毒核衣壳蛋白VP1^[14]。VP1包括两个主要的结构域，外壳(S)域和突出(P)的结构域。在动物杯状病毒中，外壳(S)域是高度保守的，突出(P)的结构域可进一步分为3个子域：N-端P1，C-端P1和P2结构域。在3个结构域中，P2结构域是最突出在病毒表面的，并且在不同的病毒间变异最大^[10]。因为P2结构域的特殊性，一般认为P2是最有可能的受体结合区域和免疫识别位点。

由于NoV在感染患者粪便中排毒量少，排毒时间短，并且没有敏感细胞及动物模型来进行培养分离鉴定^[15]，因此对NoV的研究，制备mAb，或研制疫苗等都只能依靠表达系统来完成。ORF2是NoV基因组中唯一编码结构蛋白的基因，一直都作为NoV免疫学研究的主要表达对象。Tomoko等^[16]研究证实，用E.coli表达系统也可以表达出用于免疫研究的病毒核衣壳蛋白，并且重组蛋白具有良好的抗原性。单克隆抗体技术的出现，大大推动了对生物活性物质在分子水平上的研究，如对微生物的分子流行病学调查、快速诊断、抗原物质和致病因子的分析、以及对传染病的预防和治疗等方面，都提供了强有力的手段。

本研究利用在线软件SEPPA对NoV VP1蛋白的三维空间结构进行表位预测，利用预测得到的可能的空间表位来筛选单克隆抗体，然后用得到的单克隆抗体与重组蛋白反应，看其是否也能很好的与重组蛋白结合，达到快速检测的目的。实验结果表明，用已知表位来筛选单抗是可行的。最后选择的单抗1E8不仅能与重组蛋白很好的发生结合反应，而且对天然粪便标本的反应性也很强。单抗1E8对应表位序列³⁷²DNDFETNQNT³⁸¹，位于P2结构域，也就是最突出在病毒表面的区域，与受体结合的机会是最大的。因此我们用SEPPA预测的空间表位成功筛选出了一株反应性很强的单抗，成功制备了针对我国主要流行遗传型NoV的单克隆抗体，这为我国NoV抗原检测技术的建立奠定了基础，同时也为NoV的基础研究工作提供了必要的材料。