1. Xicheng District Center for Disease Control and Prevention, Beijing, Beijing 100120, China;
2. Beijing Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China

Objective To understand the etiological characteristics of viral diarrhea in children aged<5 years in Beijing and provide evidence for the prevention and treatment of viral diarrhea. Methods Stool samples were collected randomly from diarrheal children aged<5 years in 2 grade A hospitals in Beijing in 2013. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was conducted to detect rotavirus. Polymerase chain reaction (PCR) was conducted to detect calicivirus, enteric adenovirus and astrovirus. Results A total of 243 stool samples were collected. Among these samples,the overall positive rate in virus detection was 52.7％ (128/243). The positive rate was 26.3% (64/243) for rotavirus, 16.9% (41/243) for calicivirus, 4.9% (12/243) for enteric adenovirus and 4.5% (11/243) for astrovirus. The positive samples of 4 pathogens accounted for 49.9%, 32.1%, 9.3% and 8.5% of total positive samples (including 10 co-infections, accounting for 7.8% of total positive samples).Most cases were children aged<2 years. The differences in virus detection rate among different age groups had statistical significance (χ² =13.397, P=0.009). The incidence peal varied with virus. The gender specific difference in attack rate had no statistical significance (χ²=0.220, P>0.05). Conclusion Rotavirus and calicivirus were the major pathogens causing viral diarrhea in children. The detection rate of 4 pathogens was highest in age group 12-18 months. The seasonal detection rate was highest in December. Co-infections were detected too.

Keywords:    Infantile diarrhea   Rotavirus   Calicivirus   Enteric adenovirus   Astrovirus  

1. 北京市西城区疾病预防控制中心微生物检验科, 北京 100120;
2. 北京市疾病预防控制中心, 北京 100013

收稿日期：2014-3-4

基金项目：北京市自然科学基金（No.7132045）

通讯作者：高志勇，Tel：010-64407120，Email：zhiyonggao1@163.com

目的 了解北京地区5岁以下儿童病毒性腹泻的流行病学特征，为病毒性腹泻的防治提供理论依据。 方法 全年随机采集北京市2家三级甲等医院的5 岁以下腹泻患儿粪便标本，利用酶联免疫吸附试验检测轮状病毒（HRV）、用聚合酶链反应（PCR）检测杯状病毒（HuCV）、肠道腺病毒（AdV）及星状病毒（AstV）。 结果 研究期间共收集病毒性腹泻患儿粪便标本243份，标本总阳性检出率52.7%（128/243），4种病毒阳性检出率分别为HRV（26.3%，64/243）、HuCV（16.9%，41/243）、AdV（4.9%，12/243）和AstV（4.5%，11/243），分别占总阳性检出的49.9%、32.1%、9.3%和8.5%（其中包括混合感染10例，占总阳性检出的7.8%）。患者以≤2岁儿童为主，不同年龄组之间病毒总检出率差异有统计学意义（χ² =13.397，P=0.009），不同病毒发病高峰期不同，男女罹患率差异无统计学意义（χ²=0.220，P>0.05）。 结论 HRV和HuCV是引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体；4种病毒总检出率以12~18月龄组最高；全年中以12月的病毒检出率最高；存在一定比例的混合感染。

关键词:    婴幼儿腹泻   轮状病毒   杯状病毒   肠道腺病毒   星状病毒  

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.2 标本处理

1.3 检测试剂及方法

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 HRV、HuCV、AdV、AstV

2.2 阳性病例的性别分布特征

2.3 阳性病例的年龄分布特征

2.4 不同季节及月份病毒检出的比较

3 讨论

婴幼儿腹泻是世界范围内影响儿童健康的重要疾病，甚至是全世界发病率和致死率最高的疾病之一^[1]。在中国，5岁以下儿童死亡中腹泻大约占3%^[2]，腹泻病的主要病原为病毒，其次是细菌和寄生虫。随着卫生条件的改善与抗生素的使用，儿童感染性腹泻中细菌性因素的比例逐步下降，而由病毒引起的腹泻所占比例越来越多。据了解，轮状病毒(HRV)、杯状病毒(HuCV)、肠道腺病毒(AdV)和星状病毒(AstV)是引起婴幼儿病毒性腹泻最主要的4种病原。为了解北京地区5 岁以下儿童病毒性腹泻的病原分布情况，笔者对243份样本展开了病原学研究。

本研究以北京大学第一医院、北京儿童医院2 家医院的肠道门诊作为监测哨点，随机选取2013 年1 12月期间5岁以下儿童有呕吐或腹泻症状的就诊病例共243例作为监测对象。标本采集对象均符合每日排便3次或以上，且粪便性状有改变(呈水样便、稀便等)，标本采集时间覆盖全年各月，每月采集15份左右，将采集粪便标本立即送检或-20 ℃冰箱保存备检。

加入1 ml 样本稀释液至1.5 ml EP管中，然后加入0.1 g固体粪便标本或0.1 ml液体粪便标本，至于漩涡振荡器混匀，室温静置10 min，随后8000 r/min离心5 min，吸取上清进行检测。

轮状病毒 (HRV)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自Oxoid公司；普通PCR和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测试剂Ex Taq Hot Start Version购自宝生物工程(大连)有限公司，QIAamp MinElute Virus Spin Kit，One Step RT-PCR Kit购自QIAGEN公司， HuCV、腺病毒(AdV)、AstV引物序列参考国内文献^[3]。实验采用ELISA法检测HRV，采用RT-PCR法检测HuCV及AstV，采用普通PCR法检测肠道腺病毒，操作步骤详见试剂盒说明书。

利用SPSS 19.0和Excel软件进行统计学分析，依据数据特征采用χ²检验分析，检验统计采用95%的可信区间(P=0.05)，P<0.05为差异有统计学意义。

4种病毒的检出情况 2013年1 12月共检测243份儿童腹泻标本，标本总阳性率为52.7%(128/243)。64例检出HRV，阳性率26.3%；41例检出HuCV，阳性率16.9%；12例检出肠道腺病毒，阳性率4.9%；11例检出AstV，阳性率4.5%。分别占总阳性检出的49.9%、32.1%、9.3%和8.5%。标本共包括混合感染10例，阳性率为4.1%，占总阳性检出的7.8%，以HRV混合其他病毒感染为主，患者均为2岁以下儿童，未见3种以上病毒的混合感染。

在243份儿童腹泻标本中，男女性别比为1.4 ∶ 1，其中男性病例142例，检测阳性者73例，男性患者阳性率51.4%(73/142)；女性病例101例，检测阳性者55例，女性患者阳性率54.5%(55/101)，χ²检验结果显示，男女患病风险差异无统计学意义(χ² =0.220，P=0.639)。不同病毒阳性检出率的性别分布及比较见表1，其中HRV阳性检出率女性高于男性，差异有统计学意义(P<0.05)，HuCV阳性检出率男性高于女性，差异有统计学意义(P<0.05)，其余2种病毒的阳性检出率差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 2013年北京地区243份儿童腹泻标本中4种病毒阳性检出率的性别分布及比较
Table 1 Gender distribution of positive samples of 4 viruses in 243 child stool samples in Beijing,2013

病原类型	男性(N=142)		女性(N=101)		总计(N=243)		χ2值	P值
	例数	检出率(%)	例数	检出率(%)	例数	检出率(%)
HRV	30	46.9	34	53.1	64	26.3	4.781	0.029
HuCV	30	73.1	11	26.8	41	16.9	4.409	0.036
AdV	5	41.7	7	58.3	12	4.9	0.826	0.364
AstV	8	72.7	3	27.3	11	4.5	0.451	0.502
合计	73	51.4	55	54.5	128	52.7	0.220	0.639

本次检测标本的年龄范围是1～59月龄，平均年龄(15.33±0.77)月龄，≤2岁儿童感染阳性病例115例，占总阳性标本的89.8%(115/128)。不同年龄组之间的病毒总检出率差异有统计学意义(χ² =13.397，P=0.009)，其中，12～18月龄患儿感染腹泻病毒总检出率最高(65.6%)。任一病原各个年龄组检出率之间差异均无统计学意义，HRV(χ² =5.140，P=0.273)、HuCV(χ² =4.573，P=0.334)、AdV(χ² =1.395，P=0.872)、AstV(χ² =4.538，P=0.280)。HRV各月龄组检出率以18～24月龄组最高，达到34.8%；HuCV患儿中，以18～24月龄组检出率最高(21.7%)；而AdV和AstV的检出高峰年龄组则与之不同，分别为12～18月龄、24～60月龄，见表2。

表2 2013年北京地区不同年龄组4种腹泻病毒的检出率
Table 2 Detection rate of 4 viruses causing diarrhea in different age groups,2013

年龄组 (月龄)	病例数	HRV		HuCV		AdV		AstV		总计
		阳性 例数	检出率 (%)	阳性 例数	检出率 (%)	阳性 例数	检出率 (%)	阳性 例数	检出率 (%)	阳性 例数	检出率 (%)
0~	31	5	16.1	3	9.7	1	3.2	0	0.0	9	29.0
6~	84	20	23.8	16	19.0	5	6.0	3	3.6	44	52.4
12~	61	21	34.4	13	21.3	4	6.6	2	3.3	40	65.6
18~	23	8	34.8	5	21.7	0	0.0	2	8.7	15	65.2
24~60	44	10	22.7	4	9.1	2	4.5	4	9.1	20	45.5
合计	243	64	26.3	41	16.9	12	4.9	11	4.5	128	52.7

排除10例混合感染，各季节4种病毒总检出率如下：春季(3 5月)检出率42.7%(32/75)、夏季(6 8月)检出率44.4%(20/45)、秋季(9 11月)检出率60%(27/45)、冬季(12 2月)检出率50%(39/78)，不同季节4种病毒总检出率差异无统计学意义(χ² =3.770，P=0.287)。排除10例混合感染，各月份4种病毒的总检出率差异也无统计学意义(χ² =14.750，P=0.194)。

4种病毒总阳性检出率为52.7%(128/243)，其中12月检出率最高为93.3%，7月检出率最低为33.3%。如图1所示，不同病毒各月检出率有明显的不同，HRV的阳性检出高峰主要集中在11月至次年1月，7月没有检出，各月检出率差异有统计学意义(χ² =35.378，P=0.00)。HuCV几乎全年可检出，并在10月呈现高峰，各月检出率差异有统计学意义(χ² =24.238，P=0.012)。AstV的检出集中在11月至次年3月，各月检出率差异有统计学意义(χ² =21.284，P=0.031)。而AdV的检出分布在全年的各个季节，季节性波动不大，各月检出率差异无统计学意义(χ² =16.045，P=0.139)。

图1 2013年1-12月北京地区病毒性腹泻各病原检出率
Figure 1 Detection rate of viruses causing diarrhea in Beijing, January-December,2013

本研究结果显示，在243份标本中，52.7%的标本至少检出1种病毒，4种病毒分布规律与深圳市^[4]、广州市^[5]等地相符。HRV和HuCV是引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体，与国内报道一致^[6]。本次检测发现3种组合的混合感染，HRV是混合感染中最常见的病毒，并以HRV和 HuCV组合所占比例最大，与湖南省^[7]监测结果相近，提示应重视并将混合感染情况纳入病原学研究中。

从时间分布分析，HRV的总检出率为26.3%，流行高峰季为11月至次年1月，阳性检出率高达36.4%～66.7%，而春夏季的检出率仅为19.2%。本结果与国内外各地报道的HRV腹泻发病高峰期不尽相同，在温带地区的发达国家，发病有明显的季节性规律，而在发展中国家，少数地区季节性不明显而呈终年流行，推测可能与各地温度、湿度、生活习惯、生活环境有关，也可能与各国对HRV实施计划免疫的程度相关。有资料显示发展中国家监测数据较少，但发病率却更高。虽然美国死于HRV所致疾病的儿童很少，但是用于HRV感染有关的医疗费用每年可高达3.52亿～10亿美元，实施免疫计划可以节约0.79亿美元用于卫生保健^[8]。此外。HRV虽是一种由粪-口途径传播的疾病，但多地资料表明卫生水平的高低对HRV的控制作用甚微，因此，提示我们需要加大将疫苗推广到发展中国家的力度，使疫苗接种成为降低发病率的重要手段。

HuCV感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，婴幼儿易感，目前已成为继HRV之后婴幼儿腹泻的重要病原体，HuCV感染性极强，存在多种传播途径，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播。本次监测资料显示，北京地区HuCV感染阳性率为16.9%，略高于国内其他地区的平均水平，分析可能是由北京市人员构成复杂、人口密度大、流动性大等原因造成，既往研究认为HuCV腹泻在寒冷季节呈现高发，或早春流行，但我们发现2013年北京地区婴幼儿HuCV腹泻在夏秋季持续高发，10月达到流行高峰，分析这可能是由于夏秋季节细菌滋生较多，水源、食物等易受到 HuCV感染而引起的。同时，也不排除基因型易变异或因气候变化过快而导致的病毒自身对环境的调整等因素对发病高峰期的影响。鉴于目前HuCV流行情况多变，深入进行流行病学研究更加迫切和具有意义。

监测数据显示，2013年北京地区AdV呈现全年散发，其中4 7月检出率较高，未发现明显的季节分布特点，与近年国内外研究的流行规律吻合^[3]。8 11月期间均未检出阳性病例，分析可能因为其他腹泻病毒在此期间盛行，干扰了AdV的感染，从而导致阳性率降低。而AstV 感染具有明显的季节性分布特征，在温带地区以冬季为主要流行季节，在热带地区则以雨季为主^[9]。北京地区AstV的感染主要集中在11月至次年3月，与HRV的流行季节相似。2013年AstV检出率(4.5％)较珠海市(4.04%)^[10]、乌鲁木齐市(4.2%)^[11]等非一线城市偏高，考虑这一变化可能与近年来北京地区的医学研究水平和检测技术的不断提高有关，从而增加了发现病毒的敏感性。通观4种病毒的时间分布，发病高峰交错覆盖全年，推测可能与病毒间的相互干扰有关，提示不同季节应注意防范当期主导病毒，增强预防和治疗的针对性。

从性别分布来看，4种病毒男女患病风险差异无统计学意义，但HRV和HuCV单种病毒男女患病风险存在差异，其中以HuCV差异最为显著，男性检出率约为女性的2.7倍，此结论与2013年佛山市监测结果(HuCV检出率男童是女童的2倍)基本一致^[12]。有资料显示，控制免疫球蛋白合成的基因(主要用于增加人体免疫力)，位于人体X染色体中，而女性的这种染色体比男性要多一个，因此，女婴的免疫力通常要比男婴强。由此推测HuCV男女检出率差异很可能是由这一原因所致，而缺乏持续的免疫力会造成对HuCV普遍易感，此结论目前尚无定论，但应做好预防措施，尤其降低HuCV对男性儿童的威胁。

从年龄分布来看，监测数据显示北京地区病毒性腹泻的易感人群以2岁以下儿童为主,占总阳性 标本的89.8%，与乌鲁木齐市(98.3%)^[11]等多地 研究报道相接近，其原因主要是 2岁以下儿童的消化系统发育尚不成熟，导致其对食物的耐受性较差，极易发生消化功能紊乱，另外2 岁以下婴幼儿机体内的免疫球蛋白和胃肠道 SIgA均较低，对细菌和病毒等微生物免疫力较差，因此成为感染腹泻的主要群体。本研究还发现，6月龄以内及2岁以上患儿数量较少，发病高峰主要集中在12～18月龄，分析原因可能由于月龄过低，尚未添加辅食，婴幼儿可从母体获得抗体抵御感染；而月龄过高，自身的免疫系统逐渐成熟，感染率也会有所下降，也可能是由于曾经有过感染史，体内产生了保护性抗体，从而感染率降低。提示低龄儿童的患病风险较大，应将2岁以下婴幼儿作为重点施治对象，合理制定疫苗接种时间表，加强对此类易感人群的主动监测，同时注意提高婴幼儿免疫力，避免长期滥用广谱抗生素造成婴幼儿肠道菌群失调。由于本次监测入选病例均为门诊病例，AdV 和AstV阳性样本量过少，在本次研究中未表现出明显的与年龄有关联的特征，但从年龄结构可以看出，≤2岁婴幼儿AdV、AstV腹泻的阳性例数分别占其总阳性例数的91.7%和90.9%，表明≤2岁婴幼儿也是AdV 和AstV 腹泻的高发群体，提示今后可以扩大样本来源继续评估。

本研究通过对2013年北京地区<5岁儿童病毒性腹泻的监测，获得了4种常见病毒感染在性别、年龄、季节等因素上的分布特点，为婴幼儿病毒性腹泻防控措施的调整提供了依据。目前我国针对常见病毒性腹泻的病原学研究已有了一定进展，但对于是否还有其他未被证实的致腹泻病毒或病毒亚型，尚待在临床实践中进一步探索。有必要长期开展病毒监测，扩大研究范围，以评估不同病毒引起腹泻的疾病负担，同时通过隔绝传染源、截断传播途径、提高儿童自身免疫力(母乳喂养、接种疫苗)等途径加强疾病防控。

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