感染性腹泻是一种常见传染性疾病，引起感染性腹泻的病原种类繁多，在北京地区以志贺菌、沙门菌和副溶血性弧菌为主^[1]。有效抗生素的使用是治疗感染性腹泻的关键，其中头孢类抗生素因其高效的抗菌作用被广泛应用。近年来，随着头孢类抗菌药物在临床的广泛使用，对其耐药的肠道菌株不断出现，特别是质粒携带的超广谱β-内酰胺酶类(extended spectrum β-lactamaseas，ESBLs)菌株出现，更加重了对头孢类抗生素的耐药性。单种肠道病原对头孢类抗生素耐药分析常有报道，但对主要肠道病原整体耐药状况及趋势的研究报道较少。本研究结合流行病学资料对分离的主要肠道病原菌多重耐药情况进行分析，以期评估本地区致泻肠道病原的耐药状况并深入了解造成耐药的因素，为指导临床合理使用药物和有效防控肠道传染病传播提供参考依据。

收集2008-2011年辖区内北京儿童医院、北京大学人民医院、北京大学第一医院、积水潭医院、北京市二龙路医院5家医院上送菌株及本实验室从腹泻病患者粪便标本中分离培养的肠道病原菌187株，包括志贺菌83株，其中福氏志贺菌21株，宋内志贺菌61株，鲍氏志贺菌1株；沙门菌共78株，含13种血清型，其中以肠炎沙门菌血清型为主，共30株，其次为鼠伤寒沙门菌，共10株；副溶血性弧菌共26株，含2种血清型，其中O3：K6型24株，O4：K8型2株。

对187株肠道病原按照美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI 2010)推荐的Kirby-Bauer法进行体外药物敏感性试验。选取的8种头孢类抗生素涵盖1~3代头孢菌素，分别为头孢噻吩、头孢唑林、头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟和氨曲南。抗菌药物及MH培养基干粉购自英国Oxoid公司。质控菌株使用大肠埃希菌ATCC25922，由北京市疾病预防控制中心(CDC)提供。

采用煮沸法提取菌体及质粒DNA。PCR扩增反应体系为50 μl，反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，再72 ℃延伸10 min。OXA型、TEM型、SHV型、CTX-M-1型、CTX-M-2型、CTX-M-8型和CTX-M-9型引物及反应条件见参考文献 ，引物序列由大连(宝)生物工程有限公司合成。PCR扩增在美国Bio-Rad公司的iCycler PCR上进行，PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，美国Bio-Rad公司凝胶成像系统照像。PCR阳性扩增产物委托北京金螺旋生物科技公司纯化、测序。测序使用双脱氧末端终止法，在ABI3730XL测序仪上进行双向测序，序列拼接后通过NCBI Blast程序在GenBank上查询比较，确定基因亚型。

3种肠道病原对8种头孢菌素均产生一定耐药性，其中对头孢噻吩总耐药率最高，其次为头孢哌酮和头孢唑林，分别为40.11%、18.18%和17.65%。不同病原对头孢类抗生素的敏感性不同，志贺菌对头孢噻吩、头孢唑林和头孢噻肟有较高耐药率，耐药率分别为80.72%、27.71%和24.10%；沙门菌主要对头孢哌酮耐药，耐药率为24.36%；副溶血性弧菌对头孢噻吩、头孢唑林和头孢哌酮产生一定耐药性，耐药率分别为11.54%、11.54%和15.38%，见表1。不同肠道病原对头孢类抗生素耐药程度不同，52株沙门菌对头孢类抗生素完全敏感，占66.67%，16株志贺菌对头孢类抗生素完全敏感，占19.28%，副溶血性弧菌中有14株对头孢类抗生素完全敏感，占53.85%。沙门菌耐药菌株中24.36%耐1种头孢类抗生素，耐4种以上头孢类抗生素的为1株；志贺菌耐药菌株中耐1种、2种、3种头孢类抗生素的都有检出，所占百分比为33.73%、13.25%和22.89%，耐4种以上抗生素的占10.84%。副溶血性弧菌中以耐1种、2种头孢类抗生素为主，耐≥4种以上抗生素菌株未检出，见表2。

105株耐1种及以上头孢类抗生素的肠道病原中检出34株携带ESBLs耐药基因，其中志贺菌中检出33株，沙门菌中检出1株。OXA型、CTX-M-9型、TEM型和SHV型耐药基因均有检出，其中18株携带OXA型耐药基因，11株携带CTX-M-9型，5株携带有2种ESBLs耐药基因，见表3。表2中唯一1株多重耐药沙门菌(≥4种抗生素)携带OXA型耐药基因，志贺菌中9株多重耐药菌(≥4种抗生素)均检出携带ESBLs耐药基因，其中5株检出携带2种ESBLs耐药基因。

105例肠道耐药菌分离自103例腹泻病患者(其中2例患者为复合感染)，患者中男性61例，女性42例，男女性别比为1.5 ∶ 1。肠道耐药菌从各个年龄组患者都有检出，其中20～29岁年龄组检出构成比最高，达27.18%，其次为≥40组和 < 10组，检出率分别为23.30%和21.36%。耐药志贺菌在各个年龄组均有检出，20～29岁年龄组检出构成比最高，达33.33%，其次为 < 10岁的低年龄组，为22.73%；耐药沙门菌检出构成比最高的为≥40岁的高年龄组，达30.77%，其次为 < 10岁的低年龄组，为26.93%；耐药副溶血性弧菌在 < 10岁和10～19岁年龄组都未检出，耐药菌株检出集中在30～39岁和≥40岁年龄组，检出构成比分别为45.46%和36.36%，见表4。

另外对34株分离出携带ESBLs耐药基因菌株患者进行流行病学分析发现，患者中男性18例，女性16例，男女性别比约为1 ∶ 1。检出患者的年龄组分布为 < 10岁年龄组检出13株，10～19岁检出3株，20～29岁检出14株，30～39岁检出2株，≥40岁检出2株。5株携带2种ESBLs耐药基因的菌株分别为 < 10岁年龄组检出3株，30～39岁检出1株，≥40岁检出1株。

细菌耐药是当今全球的公共卫生问题之一，由于第三代和第四代头孢菌素在临床中的广泛应用，肠道致病菌的耐药率也在逐年上升，并呈世界性流行趋势。不同病原由于其生物结构及对抗生素耐药机制不同会造成其耐药程度有所差异，如本研究发现志贺菌对头孢菌素类抗生素耐药程度最高，沙门菌和副溶血性弧菌相对敏感(表2)。近年国内研究表明，肠道病原对头孢菌素类抗生素总的耐药程度有加重趋势，如鲍春梅等^[4]对志贺菌，张新等^[5]对沙门菌，曲梅等^[6]对副溶血性弧菌耐药研究结果显示肠道主要病原的耐药状况不仅是耐药率逐年上升，并且多重耐药菌株出现概率增多。

ESBLs是由质粒介导的能赋予细菌对多种β-内酰胺类抗生素耐药的一类酶，是G^-杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的最重要因素^[7,8] 。本研究检出的34株携带ESBLs耐药基因菌株中有33株为志贺菌，这也是造成志贺菌对头孢类抗生素耐药率较高的重要原因。超广谱β-内酰胺酶分类多而复杂，到目前为止，全世界共发现超过200种ESBLs，根据其编码基因的同源性可分为5大类：TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型和其他型(如PER型、CEM型、TLA型、VEB型、SFO型、GES型)，ESBLs由于不同国家和地区应用抗生素的种类和习惯不同，而表现出不同的发生率和基因型分布。CTX-M型ESBLs为1990年Bauernfeind等^[9]首次报道，对头孢噻肟具有高水解活性，在我国大陆及台湾地区为最常见ESBLs耐药基因型^[10,11]。在北京地区，鲍春梅等^[12]报道的流行亚型为CTX-M-15、CTX-M-14和TEM-1，纪文静等^[13]报道的流行亚型为CTX-M-3、CTX-M-15、CTX-M-14、CTX-M-57同时伴有TEM-1和OXA-1型，而本研究检出最多的基因型为OXA-1亚型和CTX-M-14亚型，说明本地区流行的ESBLs耐药基因型呈多样性。另外本研究还发现，5株同时携带2种ESBLs耐药基因的菌株，其对抗生素的耐药率也明显升高，表明随着β-内酰胺酶耐药基因携带种类的增多，增加了菌株的耐药性，并且随着耐药基因携带种类不同，耐药性也会产生相应变化，与万根平等^[14]的研究结果一致。

对携带耐药菌株患者进行流行病学分析发现，不同年龄组腹泻患者都能检出携带耐头孢类抗生素菌株，但低年龄组患者( < 10岁组)携带耐头孢类菌株检出率超过20%，菌株中携带ESBLs耐药基因为13株，占38.23%(13/34)，并且检出3株携带2种ESBLs耐药基因。分析原因与喹诺酮类抗生素以及氨基糖苷类抗生素在儿童用药安全方面存在问题^[15]，限制了其在儿科的应用，导致儿科临床应用抗生素以β-内酰胺类抗生素为主有很大关系。在低龄患儿中耐头孢类抗生素菌株的高检出率也应引起临床医生的高度重视。