军团菌(Legionella)是引起军团菌病(Legionnaires'disease)的重要病原体，广泛存在于天然淡水环境与人工水系中^[1]。人类通过吸入含有军团菌的气溶胶致病，当环境水源中军团菌的浓度达到1000 cfu/ml时，就可能导致军团菌病的暴发^{[2, 3]}。传统的军团菌检测方法依赖于培养和血清型鉴定，在检测时间和范围上存在很大的局限性。由于军团菌引发的军团菌肺炎，临床症状不典型，难以与其他病原菌导致的肺炎明确区分，对临床诊断带来困难^[4]。另外国内大多数临床医生由于缺乏军团菌感染的意识，以及该细菌体外培养需要复杂的营养，所以更增加了诊断的难度。PCR酶切分型用于检测与鉴别军团菌和嗜肺军团菌，具有快速、简便之特点，可作为临床诊断之参考^[5]。新建立的实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，real-time PCR)技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法^{[6, 7]}。本实验采用real-time PCR方法中的TaqMan MGB探针法对嗜肺军团菌进行检测。TaqMan MGB探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，使得TaqMan探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离，使得荧光信号发射。使用FAM荧光检测军团菌，JOE通道检测内参，试剂盒中使用dUTP和UNG酶防止扩增产物的污染。在探针上连接MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10 ℃左右。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱代表了模板的数量，从而达到实时定量检测特异核苷酸的目的。本试验根据军团菌16S rRNA基因序列设计引物和探针^[5]，通过对军团菌标准菌株及其他细菌进行检测，验证该方法的特异性、敏感性及重复性，并用此方法对金域医学检验中心收集150例肺部感染患者的痰液标本进行检测，报告如下。

AB 7300荧光定量PCR仪和MJ PTC-200 PCR仪，其他耗材包括样本采集管、扩增管、移液枪头等均为无菌。军团菌核酸检测试剂盒(real-time PCR法)，由上海复星长征公司提供。试剂盒主要组成成分包括PCR缓冲液，军团菌荧光探针(引物序列： F1-5′-AGG GTT GAT AGG TTA AGA GC-3′R1-5′-CCA ACA GCT AGT TGA CAT CG-3′;探针序列：5′-FAM -CAG GTA GCC GCC TTC GCC ACT G-DABCYL-3′)，Taq酶，UNG酶，内参(合成病毒)，军团菌阳性、弱阳性和阴性对照，DNA提取液(磁珠法)。

5株嗜肺军团菌标准参考株：包括Philadelphia 1(ATCC 33152)、Togus 1(ATCC 33154)、Los Angeles 1(ATCC 33156)、Chicago 2(ATCC 33215)及1169-MN-H(ATCC 43703)；5株非嗜肺军团菌标准参考株：包括菲氏军团菌(Legionella feeleii 1)ATCC35072、麦氏军团菌(Legionella micdadei)ATCC 33218、戈氏军团菌(Legionella gormanii)ATCC 33342、长滩军团菌(Legionella longbeachae) ATCC33462及橡树岭军团菌(Legionella oakridgensis)ATCC 33761；10株其他病原菌：包括肺炎克雷伯菌ATCC 35657，流感嗜血杆菌ATCC 10211，奈瑟脑膜炎球菌WSB 0702，金黄色葡萄球菌ATCC 6358，粪肠球菌ATCC 29212，铜绿假单胞菌ATCC 27853，大肠埃希菌ATCC 25922，阴沟肠杆菌ATCC 13047，奇异变形杆菌ATCC 35659，嗜麦芽寡养单胞菌ATCC 51331。

2013年10-12月，金域医学检验中心收集150份肺部感染住院患者的痰液标本，患者年龄20~89岁，平均年龄59.27岁，男性87例，女性63例。在采集标本前，清晨令患者先用清水漱口数次，然后用力咳出气管深处的痰，或用吸痰器吸出气管内痰液，盛于灭菌容器中，注意勿混入唾液或鼻咽分泌物，样本采集后立即送检。

在痰液标本中加入双倍量痰消化液，37 ℃ 30 min，供作DNA提取。采用TGuide M16全自动核酸提取仪，于第一槽中加痰消化液400 μl +裂解液600 μl +磁珠20 μl，混合10 min，磁吸60 s→第二槽(清洗)+核酸清洗液500 μl，混合1 min，磁吸60 s→第三槽(清洗)+80%乙醇500 μl，混合1 min，磁吸60 s→第四槽(清洗)+80%乙醇500 μl，混合1 min，磁吸60 s→第5步，70 ℃，加热5 min→第6槽，+核酸洗脱液50 μl，洗脱DNA，吸出，放置EP管中，-20 ℃保存，供做PCR试验。

在EP管中加PCR反应缓冲液21 μl、军团菌荧光探针3 μl、Taq酶2 μl，样本DNA提取物4 μl，低速离心数秒钟，取出置全自动荧光定量PCR仪。

50 ℃ 2 min→94 ℃ 2 min→进入循环(94 ℃ 10 s→94 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s)×40→60 ℃采集FAM、JOE荧光通道的信号(按操作说明书)。

试剂盒中提供军团菌阳性、弱阳性和阴性对照各1支，每次试验必须做阳性、弱阳性和阴性对照各1管。如试剂质量完好且操作正确，军团菌阳性对照应为阳性，FAM通道Ct_阳 < Ct_弱阳 < 32，JOE通道Ct < 40，阴性对照结果为阴性，JOE通道Ct = 40，而且阳性对照和弱阳性对照扩增曲线呈明显对数增长期曲线形态，每个样本内参JOE通道的Ct值要求 < 35，检测结果应达到这些要求的标准。否则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差，若Ct值无值时，某些软件可能显示为Ct = 40、Ct>40或UNDET等。

PCR程序运行完成后按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。取高于样本噪声线和阴性对照的荧光值作为检测阈值。以FAM通道的Ct值判断军团菌DNA的存在。具体判断如下：Ct值 ≤ 35为阳性；35 < Ct < 40为弱阳性(属于检测灰区，需复检)；Ct = 40为阴性。

灰区样本要求重复检测2次，如检测结果至少1次Ct < 40判断为弱阳性。否则，判断该管为阴性。

real-time PCR试验阳性标本，作军团菌16S rRNA 386 bp 基因测序鉴定： PCR引物设计参考文献报道^[8]，序列如下：Leg386F：AGG GTT GAT AGG TTA AG AGC；Leg386R：CCA ACA GCT AGT TGA CAT CG。由广州英骏生物技术有限公司协助，所测得序列经NCBI Blast搜索引擎在GenBank军团菌核酸序列数据库中进行比对，获得各菌株鉴定结果。

通过real-time PCR 和16S rRNA基因测序验证试验结果比较，计算阳性符合率＝A/(A+C)×100%，其中A为2种方法均为阳性的例数，C为real-time PCR为阴性而16S rRNA基因测序为阳性例数。阴性符合率＝D/(B+D)×100%，其中D为2种方法均为阴性的例数，B为real-time PCR为阳性而16S rRNA基因测序为阴性例数。总符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100%。

选取10株标准军团菌(嗜肺和非嗜肺军团菌各5株)和10株其他病原菌，进行荧光定量PCR扩增实验，通过结果来证明该方法的特异性。

选取5个不同菌液浓度，10⁰~10⁴(细菌/ml)，进行16S rRNA PCR及real-time PCR试验的敏感性模拟实验。

10株军团菌均呈阳性扩增反应，10株其他病原菌均为阴性。说明该方法具有良好特异性。

16S rRNA基因 PCR其灵敏度可检测军团菌10³ cfu/ml，荧光定量PCR其灵敏度可检测军团菌10 cfu／ml。

150例肺部感染患者痰液标本，通过real-time PCR法和16S rRNA PCR基因测序法验证试验，结果显示，real-time PCR法检测27例阳性，阳性率18.0%；27例PCR阳性标本作军团菌16S rRNA基因测序验证试验，其中22例16S rRNA基因测序阳性，阳性率15.0%。real-time PCR与军团菌16S rRNA基因测序验证试验比较，阳性符合率100%，阴性符合率96.0%，总符合率97.0%；χ²检验，χ²＝3.2 < 3.84，P>0.05，说明real-time PCR法与16S rRNA PCR法与基因测序检测验证，两者结果差异无统计学意义，见表1。

军团菌传统的检测方法依赖于培养和血清型鉴定，在检测时间和范围上存在很大的局限性。由于军团菌引发的军团菌肺炎，临床症状不典型，难以与其他病原菌导致的肺炎明确区分，对临床诊断带来极大困难^[4]。本试验根据军团菌16S rRNA基因序列设计引物和探针^{[6, 7]}，建立real-time PCR试验方法，摸索试验条件、优化试验程序，改进试验方法，采用磁珠法提取样本中DNA，提高试验的敏感性，用于检测临床患者痰液标本中军团菌DNA。应用本试验方法，通过对军团菌标准菌株及其他病原菌进行检测，验证该方法具有良好的特异性和敏感性。用此方法对150例医院临床肺部感染患者的痰液标本进行检测，阳性率高达18.0%，对阳性标本通过16S rRNA基因测序验证试验，除去其中5例测序结果阴性(视其为假阳性病例)，阳性率为15.0%，说明医院呼吸道感染患者中，确实存在军团菌感染性肺炎，应引起临床医生的重视。

嗜肺军团菌是一种细胞内致病菌，老年人或其他免疫功能低下者是军团菌病(军团菌肺炎)的易感人群^[9]。本组病例，150例肺部感染患者，年龄范围20~89岁，平均年龄59.27岁。军团菌感染患者最低年龄26岁，最大年龄84岁，平均年龄62.6岁，以老年人居多，74.4%为60岁以上老年人。说明老年人、免疫力低下人群是军团菌肺炎的易感人群。

当前公认的军团菌临床检测法金标准为病原体的分离培养法，该方法具有准确、可靠的特点，结合药敏试验可提供临床用药参考。但培养法时间长(3~7 d)、取样不方便、操作复杂，容易出现假阴性结果^{[9, 10]}，而且一般实验室难以做到。荧光定量PCR法是基于PCR和特异性荧光探针的一种高效、快速、简单方法，具有较高的灵敏度和特异性^{[11, 12]}。通过活菌计数法检测其灵敏度并与常规PCR法比较，结果此方法灵敏度为10 cfu／ml，比常规PCR法高38~100倍，每个稀释度做多次重复，Ct值差异极小，具有较好的重复性，且方法简单、耗时较短，整个过程仅需2 h，说明该法是一种快速、敏感、特异的检测方法^[13]。通过荧光定量PCR法和16S rRNA PCR法基因测序验证同时对临床上150份痰液样本的检测，结果显示，荧光定量PCR法同16S rRNA PCR法检测结果差异无统计学意义，但比16S rRNA PCR法具有更高的敏感性。因此，荧光定量PCR法对军团菌 DNA检测是一种高效、快速、简单方法。