军团菌病(Legionellosis)是由军团菌(Legionella)引起的一种以发热和肺炎为主要表现的急性呼吸道疾病^[1]。由于军团菌肺炎症状不典型，临床诊断困难，常导致误诊，漏诊，致使该病病死率较高。军团菌属有50多个种组成，包括70多个血清型，其中已报道有超过20个血清型的军团菌可以引起人类疾病^[2]。军团菌广泛存在于自然界和各种人工水环境体系中，可在水中大量繁殖，然后通过流动水，冷却塔喷雾漂移或小泡喷射及蒸发作用产生的含菌气溶胶传播感染于人群^{[3, 4]}。因此水环境中军团菌检测和卫生学评价的结果对于及时采取预防控制措施，预防军团病的发生具有重要意义。

近年来，时有管道水中的军团菌引起人类军团菌感染的报道^{[5, 6, 7]}。在我国水环境中军团菌的监测主要集中在中央空调冷却塔和温泉等娱乐设施，管道水的军团菌监测时常被忽略。在本研究中，同时采用传统平板培养、普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，real-time PCR)和荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide，EMA)结合荧光定量PCR的方法(EMA-荧光定量PCR)对上海市口岸管道水中的军团菌进行定性和定量的监测，以探讨管道水中军团菌污染情况；同时对分离培养的军团菌进行脉冲场凝胶电泳分型，以探讨管道水军团菌的分子型别特征。

132份环境水样标本采集于2010年7-9月，采集地点为上海市虹桥和浦东机场。每份水样采集500 ml。

MX3000P荧光定量PCR仪为美国STRATAGENE公司产品。活性碳酵母浸膏缓冲琼脂(BCYE)、添加甘氨酸、万古霉素、多黏毒素B、放线菌酮的BCYE培养基(GVPC)、BCYE无L-半胱氨酸(BCYE-Cys)培养基及乳胶凝集试剂盒均购自英国OXOID公司。军团菌诊断血清试剂盒购自日本生研公司。PCR反应试剂、特异性引物和探针购自大连宝生物工程公司。

每份水样500 ml，利用孔径为0.22 μm的膜过滤装置进行过滤。过滤后的膜放置在15 ml的无菌离心管中，用无菌剪刀剪碎，加5 ml的无菌去离子水，置于涡旋器上剧烈振荡至少2 min。

浓缩以后的水样经8000 r/min离心15 min，弃上清，用1 ml重蒸水洗细菌沉淀。采用QIAGEN基因组DNA试剂盒，按照操作说明提取制备DNA模板，最后用100 μl洗脱液进行洗脱。浓缩水样同时接种GVPC平板培养及计数。

浓缩以后的水样经8000 r/min离心15 min，弃上清，用1 ml重蒸水洗细菌沉淀。涂布100 μl于GVPC培养基平板上，置(36±1) ℃，CO₂培养箱培养10 d，对平板上的菌落数进行计数。从每个GVPC平板上至少选择3个可疑军团菌菌落分别接种到BCYE和BCYE-Cys平板上进行2次培养，(36±1) ℃培养至少2 d。在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的为疑似军团菌，进一步用军团菌诊断血清鉴定血清群。

根据16S rRNA 基因序列设计引物，用来检测军团菌，该引物能够特异性地扩增军团菌属菌株DNA。引物序列为上游：5′-AAG ATT AGC CTG CGT CCG AT-3′；下游：5′-GTC AAC TTA TCG CGT TTG CT-3′^[8]。预期扩增片段长度为654 bp，反应体系为0.2 mmol/L dNTP、0.2 μmol/L 引物、1 U Taq酶、1×PCR 缓冲液。扩增条件为预变性95 ℃ 1 min，1个循环；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min进行35个循环。终末延伸温度为72 ℃ 5 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液中电泳检测PCR扩增条带。

real-time PCR使用TaqMan探针法^[9]。总反应体系为20 μl，包括premix EX Taq 10 μl，引物序列为上游：5′-ACT ATA GCG ATT TGG AAC CA-3′，2 μl； 下游：5′-GCG ATG ACC TAC TTT CGC AT-3′，2 μl探针HEX-CCG CGC CAA TGA TAG TGT GAG GC-BHQ 2 μl，模板DNA 2 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，用 ddH₂O 补足至 20 μl。反应条件为95 ℃ 2 min，1个循环； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。嗜肺军团菌ATCC33152基因组DNA按照10倍梯度稀释10⁸～10⁰的9个浓度的对数为横坐标，以PCR反应的循环数(Ct)为纵坐标绘制标准曲线。

水样浓缩液低温高速离心，弃上清液，沉淀重悬于少量生理盐水中。将此悬浊液分为2份，一份加入25 μl 浓度为10 μg/ml 的EMA溶液，一份做空白对照。于4 ℃适时遮光静止。待EMA共价结合于死菌DNA之后，用可视光适时照射，裂解死菌染色体DNA。之后，低温高速离心，集菌后用核酸提取试剂盒提取DNA。根据上述引物和探针，做好内参和外参的标准曲线，用real-time PCR检测活菌数量。同时，与传统的细菌培养计数方法，普通PCR法，real-time PCR法进行平行试验。

采用传统的细菌培养计数法、普通PCR法、real-time PCR和EMA-荧光定量PCR法对132份管道水进行了军团菌检测，见表1。传统细菌培养计数法检出阳性样本25份，阳性率为18.9%；常规PCR法检出阳性样本27份，阳性率为20.5%；real-time PCR法检出阳性样本32份，阳性率为24.2%；EMA-荧光定量PCR法检出阳性样本32份，阳性率为24.2%。

传统细菌培养计数法检测结果为阳性的样本，real-time PCR法检测全部为阳性。real-time PCR法较细菌培养计数法检测阳性率提高5.3%。EMA-荧光定量PCR法和real-time PCR法检出阳性标本相同，即定性检测结果一致。

采用细菌培养计数法、荧光定量PCR法和EMA-荧光定量PCR法对阳性标本进行了计数分析。

25份培养阳性标本中，军团菌菌量计数在50～1320 cfu/L之间。军团菌含量≤50 cfu/L 的有6份，在50.1～500 cfu/L 之间的有11份，>500 cfu/L的有8份，见表2。

荧光定量PCR检测32份阳性管道水水样的军团菌DNA含量在20～13 085 GU/L之间。其中1份水样的军团菌DNA含量≤50 GU/L，13份在50.1 ～500 GU/L之间，15份在500.1～5000 GU/L之间，>5000 GU/L的有3份(表2)。

EMA-荧光定量PCR检测32份阳性管道水水样的军团菌活菌DNA量在10～4480 GU/L之间(表2)。其中9份水样的军团菌活菌DNA量≤50 GU/L，7份在50.1～500 GU/L 之间，16份在500.1～5000 GU/L之间(表2)。

对于132份水样，平板培养计数法、real-time PCR和EMA-荧光定量PCR的样本含菌量平均值分别为415.2 cfu/L、2036.6 GU/L 和629.9 GU/L；3种定量方法对军团菌含量分析的定量数值大小差异有统计学意义(χ²=193.6，P < 0.01)，其中real-time PCR的定量数值最高，EMA-荧光定量PCR的数值次之，平板培养的数值最低。

在32份军团菌阳性管道水样中，有21份(65.6%)的检出值为real-time PCR>EMA-荧光定量PCR>平板培养计数的情况；另外11份阳性水样中，平板培养计数的数值大于荧光定量PCR或者EMA-荧光定量PCR的数值。

人工水环境，如中央空调冷却塔水、温泉水、管道水等是军团菌感染的主要来源，目前国内针对军团菌污染状况的研究大部分是针对空调冷却塔水，其军团菌污染率在33.3%～58.9%之间^{[10, 11]}。但是，近年来国外有研究报道表明，管道水中存在一定量的军团菌，而且分离出的军团菌也会引起疾病的发生^{[12, 13]}，在中国对管道水中军团菌的监测工作没有系统的展开，关于此内容的报道还很少见。本研究针对2010年上海市虹桥和浦东机场各管道水进行军团菌的检测，结果显示，管道水中军团菌分离率为18.9%，同时针对军团菌核酸检测的方法检测阳性率达24.2%。

军团菌病是一种新发传染病，以小范围暴发和散发病例为主，多见于院内感染、社区性感染和旅行相关性感染^{[14, 15]}。在欧美国家屡有军团菌散发病例甚至暴发的报道，在中国周边国家，如日本等每年也有数十例军团菌病发生^[16]。中国在1981年首次报道了军团菌病例，近年也有军团菌病例的报道，并且首次使用分子分型的手段首次证明我国存在ST-36型Philadelphia-1国际流行菌株^[17]。另外，针对健康人群的研究表明，暴露人群血清中军团菌抗体阳性率为 9.9%^[18]。结合病例研究、血清学调查以及环境中大量军团菌存在的证据，我们认为有必要在我国对军团菌和军团菌病进行系统的监测。常规的军团菌检测和监测方法是培养法。在本研究中我们同时应用传统培养法、real-time PCR和EMA-荧光定量PCR 3种方法对132份管道水水样进行了定量检测。结果显示，real-time PCR和EMA-荧光定量PCR的方法比传统培养法更加灵敏，并且节省实验时间。EMA结合荧光定量PCR方法利用了荧光染料EMA在光活化作用下能切断死菌DNA，在荧光定量PCR的检测中，成功扩增活菌DNA的原理，准确地对样本中的军团菌活菌进行定量。针对实验结果，出现了细菌培养计数法结果低于EMA-荧光定量PCR法的样本(HQ2-4、HQ2-11)，考虑这类的样本里可能还有很多活的非可培养(VBNC)状态的细菌。理论上讲，处于VBNC状态的细菌在一定条件下可以恢复为可培养的状态，有致病的可能。所以在进行环境中军团菌检测时，不仅应检测和监测可培养的军团菌，也需检测和监测VBNC状态军团菌。这一点上EMA-荧光定量PCR的灵敏度和对有致病潜力的菌株检测的准确性要优于传统的平板培养法。此外，EMA-荧光定量PCR方法的定量结果低于细菌培养计数法的样本(HQ2-30)，这类型的样本结果可能是某些PCR的反应条件影响了实验结果。因为只有活菌才能感染人体引起疾病，检测环境水体中的活菌比检测总的军团菌含量更有意义，所以应用不同的方法对水样标本中军团菌含量，特别是活菌含量，进行准确定量，可以正确评估军团菌病暴发的风险因素，对于及时采取预防控制措施，预防军团病的发生具有重要意义。