疾病监测  2014, Vol. 29 Issue (6): 488-490

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海岩, 王文瑞, 郭卫东, 跃华, 张慧娟, 魏建春
HAI Yan, WANG Wen-rui, GUO Wei-dong, YUE Hua, ZHANG Hui-juan, WEI Jian-chun
内蒙古地区炭疽芽胞杆菌基因单核苷酸多态性研究
Study on the single nucleotide polymorphism in gene of Bacillus anthracis isolated in Inner Mongolia
疾病监测, 2014, 29(6): 488-490
Disease Surveillance, 2014, 29(6): 488-490
10.3784/j.issn.1003-9961.201.06.019

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收稿日期：2014-02-07
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海岩, 王文瑞, 郭卫东, 跃华, 张慧娟, 魏建春. 内蒙古地区炭疽芽胞杆菌基因单核苷酸多态性研究[J]. 疾病监测, 2014, 29(6): 488-490.
HAI Yan, WANG Wen-rui, GUO Wei-dong, YUE Hua, ZHANG Hui-juan, WEI Jian-chun. Study on the single nucleotide polymorphism in gene of Bacillus anthracis isolated in Inner Mongolia[J]. Disease Surveillance, 2014, 29(6): 488-490.
内蒙古地区炭疽芽胞杆菌基因单核苷酸多态性研究
海岩1, 2, 王文瑞1, 郭卫东1, 跃华1, 张慧娟3 , 魏建春3    
1. 内蒙古自治区疾病预防控制中心, 内蒙古 呼和浩特 010031;
2. 内蒙古农业大学, 内蒙古 呼和浩特 010018;
3. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206
收稿日期:2014-02-07
作者简介: 海岩，男，内蒙古自治区通辽市人，主管检验师，博士研究生在读，主要从事传染病监测和控制工作
通信作者：张慧娟，Tel：010-58900771,Email：zhanghjhysh@163.com
摘要：目的 研究内蒙古地区炭疽芽胞杆菌基因单核苷酸多态性（SNP）特征。 方法 选择内蒙古地区不同分离年代、地点和来源的22株炭疽芽胞杆菌，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）方法扩增染色体上的13个SNP位点，进行聚类分析。 结果 使用的13个SNP位点中8个位点相同，5个位点存在多态性。通过聚类分析，22株炭疽芽胞杆菌可分为4个群，属于A.Br.Aust94亚群和A.Br.008/009亚群的菌株各有1株，A.Br.Ames亚群和A.Br.001/002亚群菌株占大多数。 结论 内蒙古地区炭疽芽胞杆菌基因SNP位点具有遗传稳定性，目前5个SNP位点可作为内蒙古地区炭疽杆菌荚膜质粒SNP位点基因分型的指标，A.Br.Ames亚群和A.Br.001/002亚群是内蒙古地区优势亚群。
关键词： 炭疽芽胞杆菌    单核苷酸多态性    亚群    
Study on the single nucleotide polymorphism in gene of Bacillus anthracis isolated in Inner Mongolia
HAI Yan1, 2, WANG Wen-rui1, GUO Wei-dong1, YUE Hua1, ZHANG Hui-juan3 , WEI Jian-chun3    
1. Inner Mongolia Center for Disease Control and Prevention, Huhhot 010031, China;
2. Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, China;
3. Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract:Objective To study the characteristics of single nucleotide polymorphism(SNP)in gene of Bacillus anthracis isolated in Inner Mongolia. Methods Twenty two Bacillus anthracis isolates from different sources were selected. The 13 SNP sites were amplified by using real-time PCR, and related clustering analysis was conducted. Results The identified isolates had the same sequence in 8 sites and different nucleotide sequence in the other 5 sites of the 13 SNP sites. The 22 Bacillus anthracis isolates were divided into 4 groups by cluster analysis. One A.Br.Aust94 strain and 1 A.Br.008/009 strain were detected. Twenty strains belonged to A.Br.Ames and A.Br.001/002 subgroups. Conclusion The analysis showed that single nucleotide genetic stability and the 5 discriminating SNP sites could be used as indicators in genotyping the Bacillus anthracis isolated in Inner Mongolia. A.Br.Ames and A.Br.001/002 subgroups were the clusters predominating in Inner Mongolia.
Key words: Bacillus anthracis    Single nucleotide polymorphism    Subgroup    

炭疽(anthrax)是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人兽共患的自然疫源性疾病，炭疽芽胞杆菌属于需氧芽胞杆菌属，草食动物是炭疽芽胞杆菌的易感动物。该菌通过土壤或动物接触传播，呈世界范围流行[1]，我国每年均有人间炭疽散在局部流行，西北部10个省(区)为高发区。内蒙古地区1913年就有炭疽的记载[2]。随着人群生活水平的提高和防病意识的增强，炭疽发病呈稳步下降的趋势，但伴有局部小规模的暴发。不仅严重影响人类健康还影响草食家畜养殖业和进出口贸易经济的发展。炭疽芽胞杆菌是一种高度保守的革兰阳性细菌，不同菌株间基因同源性在99%以上。在细菌进化过程中，基因组序列上存在能稳定遗传的单核苷酸突变位点，通过分析单核苷酸突变位点在不同菌株中的多态性，将不同菌株划分为不同基因型。单核苷酸多态性(SNP)分析是现有的基因分型方法中仅少数适用于该菌株的基因分型方法之一[3, 4, 5]。2007年，Van等[3]通过对炭疽芽胞杆菌测序菌株的研究，确定了13个CanSNP位点，结合多位点可变数目串联重复序列分析方法(MLVA)方法有效地将不同菌株进行了基因分型，认为这些位点可代表炭疽杆菌的遗传进化特征。为了解内蒙古地区炭疽杆菌的基因SNP特征，本研究利用文献报道的13个CanSNP位点对内蒙古地区分离的炭疽芽胞杆菌进行基因分型。该研究有利于掌握内蒙古地区流行的主要基因型，便于进出口贸易和生物安全防控领域的溯源分析，为区分本土病原和外来病原提供依据。现将分析结果报告如下。

1  材料与方法 1.1  实验菌株

分离自内蒙古地区炭疽芽胞杆菌22株，分离年代为1955 2012年，分离来源主要为皮肤炭疽患者，还有部分来自病死动物和土壤，菌株来源见图1。

图 1 内蒙古地区炭疽芽胞杆菌SNP位点聚类分析图 Fig.1  Cluster analysis result of SNP sites of Bacillus anthracis isolated in Inner Mongolia 注：1代表碱基A； 2代表碱基T； 3代表碱基C； 4代表碱基G。
图选项
1.2  主要试剂及仪器

TaKaRa Premix Ex TaqTM(Code No.RR390A)、引物和探针序列信息参见文献[3]，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，由传染病预防控制国家重点实验室提供，见表1。仪器为ABI 7500 Fast型荧光定量PCR仪。

表 1 引物探针序列 Table 1 Primer probe sequence
标准SNP亚群   引物序列 5′~3′   探针序列5′~3′
A.Br.001
CAA GCG GAA CCA AAT TTA ATC TTT
TTC ACC GTA CGT CAT TGT ATA ATA CG		FAM-ACC GAA ACT TGA AGT C-MGB
VIC-AAA CCG AAA TTT GAA GTC-MGB
A.Br.002
AAC GAT ACC TAA AAT CGA TAA AG
GGC AGA AGG AGC AAG TAA TGT T		FAM-CGC CCA GCC TAA-MGB
VIC-CGC CCA ACC TAA A-MGB
A.Br.003
GCT ACT GTC ATT GTA TAA AAA CCT CCT TT
CGC TTG CCA AGC TTT TTT TC		FAM-TAC CTC AAG CTT AAT TC-MGB
VIC-CTA CCT CAA ACT TAA TTC-MGB
A.Br.004
CCG ATA CCA GTA AAC GAC GAC AT
CTG GAA TTG GTG GAG CTA TGG A		FAM-TTG GAA TGC CCC TAA T-MGB
VIC-CTT TGG AAT GTC CCT AAT-MGB
A.Br.006
CCG GAA ATT GCT ATT AGA ACG AA
TCC CAA TCTA GCG TTT TTA AGT TCA		VIC-CAT CGC CTC GTG CA-MGB
FAM-CCA TCG CCT AGT GC-MGB
A.Br.007
TTG GTA ACG AGA CGA TAA ACT GAA TAA
GCC TTG GAT TGG CGA TTG		6FAM-CAT CCT TAC ATT CAG CT
VIC-CCA TCC TTA TAT TCA GCT C
A.Br.008
TTC GCA ACT ACG CTA TAC GTT TTA GAT
CAA ACG GTG AAA AAG TTA CAA ATA TAC G		FAM-ATA ATT CTT CGC CGC TTG-MGB
VIC-ATT CTT CTC CGC TTG TT-MGB
A.Br.009
GGC AAT CGG CCA CTG TTT
GGG TTT CTA CTG TGT ATG TTG TTA ATA AAA AG		VIC-CGG CTT TAC TTG CAT C-MGB
FAM-CGG CTT TGC TTG C-MGB
B.Br.001
TGC ATG CTT CTT CTT ACA GAG TAG TTA AT
CGG TCA TAA AAG AAA TCG GTA CAA		FAM-CGA TAC CTT CTT ATC CTC-MGB
VIC-CGA TAC CTT CTT ATC TTC-MGB
B.Br.002
TGT TGC ACC TTC TGT GTT CGT T
GTA GTG GCT TCA CCG AAT GGA		FAM-CGT TAC TGC TGT TCC-MGB
VIC-AAC GTT ACT TCT GTT CCT-MGB
B.Br.003
CAT TTA TTC GCA TAG AAG CAG ATG A
TGT GCC ATC AAA TAA CTC TTT CTC AA		FAM-ACA TAT CCA CTT CAC G-MGB
VIC-CAT ATC CGC TTC ACG-MGB
B.Br.004
GAA GTT AAG TAT CAA CCA GCA GAA GAA A
CCG CCG CCT TGA GCT T		VIC-CTT TAC TTC TAC CAT CCC-MGB
FAM-CTT TAC TTC TAT CAT CCC-MGB
A/B.Br.001
GAA GGT CTC CAA TTT GGA TTT AAA AT
CGT GTG AAC CTT TCG GTA AAT AGT C		6FAM-TTT TAT TTA GAA GAT AGC GGC
VIC-TTT ATT TAG GAG ATA GCG GC
表选项
1.3  方法[6, 7] 1.3.1  模板制备

炭疽芽胞杆菌接种到LB平板，37 ℃，12 h培养；挑单个菌落接种LB培养基，37 ℃孵育12 h。用接种环挑取菌苔，悬于700 μl纯水中，100 ℃加热20 min，上清液过滤除菌，即为DNA模板。

1.3.2  实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测

反应总体系20 μl 包括10 μl Premix Ex TaqTM (2×)，1 μl模板，上下引物及探针各0.2 μmol/L，加无菌纯水至20 μl。PCR扩增条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，45个循环；40 ℃，30 s。

1.4  结果分析

根据所检测到的荧光信号是FAM还是VIC，对照探针序列，确定所检测的SNP位点是哪一种核苷酸。对照参考文献[3]确定菌株所属的亚群。

2  结果

结果显示，所有菌株在13个SNP 位点中8个位点呈现SNP序列单一性，其余5个SNP位点在不同菌株间具有多态性。根据这些位点进行聚类分析，发现22株菌可分为4个群。分别为A.Br.Ames、A.Br.001/002、A.Br.Aust94和A.Br.008/009亚群。其中12株菌属于A.Br.001/002亚群，8株属于A.Br.Ames亚群，另外A.Br.Aust94亚群和A.Br.008/009亚群的菌株各有1株。不同年代、不同宿主来源的内蒙古地区22株炭疽芽胞杆菌菌株没有明显的聚集性，不同地区也没有聚集性，见图1。

3  讨论

我国每年均有人间炭疽散在局部流行，内蒙古地区为炭疽自然疫源地，近几年炭疽发病呈稳步下降的趋势，但伴有局部小规模的暴发。2011年8 9月在内蒙古兴安盟地区就有炭疽的暴发。针对这种情况本研究利用文献报道的13个CanSNP位点对内蒙古地区分离的炭疽芽胞杆菌进行基因分型。该研究有利于掌握该地区流行的主要基因型，为区分本土病原和外来病原提供依据。

本研究中所用到的CanSNP位点是一套保守的位点，Van等[3]对1033株世界分离株的研究只发现3个群，12个亚群。该方法适用于地域广泛的炭疽芽胞杆菌菌株的遗传进化关系研究。在我国内蒙古自治区范围内，使用这种方法进行基因分型的意义有限，但通过我们的研究，可以对内蒙古地区的菌株有一个初步的了解，为全国炭疽芽胞杆菌的遗传特征分析提供基础资料。

2009年，Simonson 等[8]研究了中国炭疽芽胞杆 菌分离株的地理分布。发现191株中国菌株分为5个亚群，分别是A.Br.008/009、A.Br.Aust94、A.Br.Vollum、A.Br.001/002和A.Br.Ames。A.Br.001/002在中国的分布最广泛，A.Br.Ames仅次于A.Br.001/002，主要发现于内蒙古地区。而A.Br.008/009、A.Br.Aust94和A.Br.Vollum亚群主要分布于新疆地区。本次研究的内蒙古菌株与该研究结果相符，除A.Br.Vollum 亚群外，发现了5个亚群中的4个，A.Br.001/002和A.Br.Ames亚群占绝大多数，另2个亚群各有1株分离株。由此基本可以确定在内蒙古地区流行的优势亚群为A.Br.001/002和A.Br.Ames亚群。该结果基本掌握了内蒙古地区流行的主要基因型，为以后研究提供了基础资料。

本研究通过对内蒙古地区分离的现有菌株进行SNP的特性研究，基本建立了有效的炭疽调查、监测及溯源研究方法。下一步需要更多的实验菌株进行进一步的验证。结合其他的分子分型方法如可变数量串联重复序列研究可更好地进行分析，获得更有实际应用价值的分子分型方法。

参考文献
[1] Wu BR, Yuan WL, Zhaori GT. Epidemiology analysis of anthrax in Inner Mongolia Autonomous Region from 1956 to 1989[J]. Chinese Journal of Zoonoses,1992,8(1):47-48.(in Chinese)吴秉仁,原万伦,照日格台.内蒙古自治区1956-1989年炭疽病流行情况分析[J].中国人兽共患病杂志,1992,8(1):47-48.
[2] Van Ert MN, Easterday WR,Huynh LY, et al. Global genetic population structure of Bacillus anthracis[J]. PLoS One,2007,2(5):e461.
[3] Kiel JL, Parker JE, Holwitt E,et al. Geographical distribution of genotypic and phenotypic markers among Bacillus anthracis isolates and related species by historical movement and horizontal transfer[J].Folia Microbiol,2008,53(6):472-478.
[4] Read TD, Salzberg SL, Pop M, et al. Comparative genome sequencing for discovery of novel polymorphisms in Bacillus anthraci[J].Science,2002,296(5575):2028-2033.
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[6] Easterday WR, Van Ert MN,Simonson TS,et al. Use of single nucleotide polymorphisms in the plcR gene for specific identification of Bacillus anthracis[J].J Clin Microbiol,2005,43(4):1995-1997.
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