登革病毒(Dengue virus，DENV)主要通过伊蚊叮咬传播，是一类严重危害人类健康的虫媒病毒。目前DENV广泛流行于热带和亚热带的100多个国家及地区，约50%人口生活于有感染风险的地区，每年约有3.9亿人口感染DENV^[1]。DENV可分为4个血清型(DENV 1~4)，均可引起登革热(dengue fever，DF)、登革热出血热(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革热休克综合征(dengue shock syndrome，DSS)，其中以登革热为最常见。

浙江省义乌市是全球最大的小商品集散中心，国际、国内贸易频繁，属亚热带气候，适宜于媒介伊蚊的生长繁殖。每年与东南亚、非洲和南美等登革热疫区人员交往密切，义乌市自2009年暴发输入性登革热3型病毒疫情以来^{[2, 3]}，常有来自国外疫区的输入性病例。2013年6月义乌市报告了1例输入性登革热疑似病例，从患者血清中分离到1株DENV并进行了全基因组序列测定和分析。

陈某某，男，56岁，2013年曾在安哥拉居住半年。患者于2013年6月12日晚上从安哥拉到达义乌，出现发热，肌肉酸痛等症状，最高体温约39 ℃。次日，自行到义乌市疾病预防控制中心(CDC)咨询，当天即采集患者血清标本，并送至该中心实验室检测。

DENV特异性IgM抗体采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，试剂购自澳大利亚Panbio公司，按试剂盒说明书进行检测和判断结果。

C6/36细胞由浙江省CDC病毒所提供。患者早期血清用细胞培养液适当稀释后，接种于C6/36细胞，置CO₂恒温培养箱培养。每日于倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)，待75%以上细胞出现病变，收取细胞上清液。

RNA提取用MagMax Express 自动核酸提取仪并配合MagMax-96 Viral RNA Isolation Kit 试剂盒(美国ABI公司)，按试剂说明进行提取。取血清标本或病毒培养细胞上清液200 μl，最终获得50 μl RNA提取液作为模板。

DENV核酸检测采用DENV通用和型特异性荧光定量RT-PCR法，引物序列和实验方法参照中华人民共和国卫生行业标准-登革热诊断标准(WS 216-2008)(附录A. 登革热病原学检测方法)。

DENV全基因组委托上海辉睿生物科技有限公司测序。测序完成后对序列进行校正，利用NCBI的Blast对GenBank数据库进行同源性检索，数据处理和序列比对采用DNAman、DNAstar和ClustalX等软件，利用Mega 5.0软件Neighbor-joining法建立系统进化树，Bootstrap次数设置为1000。

用ELISA法检测登革热病例血清标本中的DENV IgM抗体，结果为阳性。RT-PCR法对病毒核酸分别用DENV通用和分型荧光PCR扩增，结果DENV核酸和DENV 1型核酸均为阳性。

将血清标本进行适当稀释，接种到C6/36细胞单层上，每天观察CPE情况。在接种后第4天后，观察到细胞单层被破坏、细胞肿胀、细胞融合产生空泡等典型的CPE。第5 天及第6 天后病变逐渐增多，而阴性对照细胞未出现病变，见图1。病毒培养上清液提取RNA经RT-RCR法鉴定后，结果显示为DENV 1型，与血清的RT-PCR结果一致。

图 1 C6/C36细胞病变图 Fig.1 Cytopathic effect of C6/36 cell

图选项

经全基因组测序并拼接后，新分离病毒全长10 141 bp，4种核苷酸的组成分别为A 含量为32.0%，G 为25.9%，T 为21.6%，C 为20.5%。含单一开放读码框，基因序列依次5′-C-PreM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′，全基因组序列经Blast 分析结果也显示其为1型DENV，命名为Zj/yw01(GenBank No：KF864667)，与2013 年提交的安哥拉1型DENV(GenBank No. KF184975)同源性最高^[4]，达99%。

Zj/yw01病毒株全基因组与来自GenBank中的国内外不同时期的46株1型DENV进行系统进化分析，并选取DENV 2、3和4型各1株作为外群构建系统进化树，Zj/yw01与2013年安哥拉分离株(KF184975)关系最近，与1998年科特迪瓦分离株(AF298807)位于相近分支^[5]，同属1型DENV的Ⅴ亚型，见图2。

图 2 登革病毒1型全基因组系统进化树 Fig.2 Phylogenetic tree based on complete genome sequences of DENV-1

图选项

不同国家分离株E基因同源性分析显示，Zj/yw01病毒株与安哥拉分离株(KF184975)核苷酸和氨基酸同源性分别为95.9%和99.4%；与1998年科特迪瓦分离株(AF298807)核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%和99.6%。与其他国内外流行株核苷酸同源性为89.9%～94.3%，氨基酸同源性为96.9%～99.2%。Zj/yw01的E蛋白区 氨基酸序列有2个糖基化位点，分别位于E蛋白的67-69(N—T—T)和153-155(N—E—T)位，与所比较的登革1型毒株糖基化位点相同。E蛋白相关毒力位点E44(E)、E156(T)、E366(N) 3均无变异。

以往研究表明，不同地域DENV流行株存在一定差异，基因型分布具有明显地域性。Rico-Hesse^[6]把1型DENV分成5个基因亚型(Ⅰ~Ⅴ)，近几年DENV的基因多样性正在增加，导致产生大量不同毒力的病毒株，人类将面临更多样的致病性DENV攻击^[7]。所以分离DENV，并对病毒基因组进行测序分析，对了解登革热的流行趋势和规律、流行病学监测和有效的预防措施等具有重要作用。本研究对DENV全基因组和E基因系统进化分析表明，Zj/yw01病毒株与非洲的2株1型DENV(安哥拉分离株KF184975、科特迪瓦分离株AF298807)关系较近，同属基因1型Ⅴ亚型^[8]。由于AF298807株分离自1998年西非科特迪瓦共和国的一名法国军人，而KF184975株分离自2013年安哥拉登革热暴发的病例，流行病学调查显示，本次义乌市患者曾于2013年在安哥拉居住半年后返回，序列分析提示本次分离的Zj/yw01病毒株最有可能来源于非洲安哥拉。

包膜蛋白(Envelope，E)是DENV的主要结构蛋白，E基因编码一个54.5×10³的糖蛋白^[9]，在病毒感染、免疫和免疫病理损伤过程中起重要作用^{[10, 11]}。Zj/yw01株E蛋白2个糖基化位点及其相关毒力位点与所比较的1型DENV分离株相同，此次输入性病例的症状较轻，结合2013年安哥拉登革热暴发的疫情资料分析，推测Zj/yw01很可能为弱毒株。

埃及伊蚊和白纹伊蚊是登革热主要传播媒介，如当地有媒介伊蚊分布，一旦登革热病例输入，很有可能引起本地流行^[12]，2009年义乌市登革热局部流行就与输入性病例有关^[2]。本次通过实验室快速检测和应急处置，对防止因登革热输入性病例引起局部流行具有重要意义。