狂犬病(rabies)是由狂犬病毒(rabies virus，RV)感染引起的一种死亡率极高的人畜共患传染病，临床上主要表现为狂躁不安、行为异常、进行性麻痹及最终死亡^[1]。该病在全球广泛分布，其中亚洲和非洲最为严重，我国狂犬病仅次于印度，位于全球第2位^[2]。2006年以前我国狂犬病疫情呈现逐年上升^[3]，2007年以来出现逐年缓慢下降的趋势^[4]。2006 2011年云南省狂犬病发病数逐年增多，疫区范围不断扩大。

狂犬病自然贮存宿主为野生动物，犬和猫是狂犬病的主要传染源，绝大多数人狂犬病由犬伤所致^[5]。以往报道猪、驴、鼠类等动物也可致人间狂犬病例的发生^[5]。近年来云南省许多地区不断涌现“疯犬”咬人或家养动物事件^{[6, 7]}，“疯犬”多表现为狂躁不安、主动攻击等反常行为，多数“疯犬”发生多次咬伤事件，有的人或动物被咬伤之后出现了狂躁不安、意识障碍等表现，目前已成为该省严重的公共卫生问题和社会问题。笔者对收集的云南省2011-2012年动物狂犬病疫情资料以及一些患者、家犬、鼠类标本进行了狂犬病毒实验室检测，并进行了分子流行病学分析，报道如下。 1 材料与方法 1.1 材料

2011-2012年采集到云南地区发病动物脑组织60份、患者唾液4份共64份，并收集相关疫情资料。2012年1 9月采集滇南地区看似健康犬脑组织67份、滇中地区看似健康犬脑组织109份、滇西地区看似健康犬脑组织6份共182份，滇中地区鼠脑组织29份、滇西地区鼠脑组织44份共73份。 1.2 直接免疫荧光试验(direct immunofluoreseence assay，DFA)

取标本进行印片，干燥后冷丙酮(4 ℃)固定10 min，用荧光素标记抗狂犬病毒单克隆抗体染色，37 ℃湿盒30 min，PBS振洗2次，蒸馏水振洗1次，90%甘油封片，Nikon荧光显微镜观察结果，观察到明亮黄绿色荧光确定为病毒抗原检测阳性。 1.3 反转录-聚合酶链反应 (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)

用QIAamp viral RNA Mini Kit(50，Qiagen公司)提取阳性标本总RNA，经Ready To-Go You Prime First Strand Beads(Amersham公司)试剂盒，利用六碱基随机引物反转录得到第一链cDNA。以cDNA为模板，应用文献中引物及条件对狂犬病毒核蛋白(N)基因片段进行扩增^[8]。PCR反应总体积为25 μl，应用Promega公司GoTaqGreen Master Mix(2×)试剂盒在Biometra TProfessional PCR仪中进行二次PCR扩增，以无菌水为阴性对照，无阳性对照。第一次扩增时取5 μl cDNA为模板，第二次扩增时取第一次扩增产物1 μl作为模板。取二次PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶检测，DNA标准为DL2000，加样量5 μl/孔。 1.4 基因序列测定及分析

PCR阳性产物送上海生工公司进行序列测定。将所得到的序列通过Internet网进入美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)站点后，利用Blast工具以及采用DNAstar中的MegAlign软件对序列进行同源性比较，运用Mega 6.06软件Neighbor-joinjing法(Bootstrap值设定为1000)构建系统进化树。 2 结果 2.1 疫情资料

共收集到疫情资料64份，其中2011年收集到病犬资料24份和病驴资料1份，2012年收集到病犬资料34份和病猪资料1份及患者病例资料4份。其中58只病犬均出现了咬伤人或家畜现象，有的在1~2天内发生多次咬伤人或家畜事件，表现较为狂躁、主动攻击等一些较为反常的行为；1头驴和1头猪被疯犬咬伤后，出现了狂躁不安等行为异常的表现；4例患者均由疯犬咬伤之 后，出现了烦燥、意识障碍。 2.2 实验室检测结果

对60份患病动物样本进行DFA检测，结果抗原检测阳性26份，阳性率43.33%，见图 1。其中春季1例、夏季14例、秋季7例、冬季4例，见图 2。滇中10例、滇南8例、滇西8例，见图 3。对182份健康犬脑进行DFA检测，结果抗原检测阳性2份(均来源于滇中地区)，阳性率1.10%，见表 1。对4份患者唾液和73份鼠脑进行DFA检测，结果抗原检测均阴性。

图 1 DFA检测狂犬病毒抗原阳性(A)和阴性(B)结果 Figuer 1 Antigen positive (A) and negative (B) for rabies virus by DFA

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对28份抗原检测阳性样本进行RT-PCR病毒N基因检测，结果有25份(23只发病动物和2只健康犬)扩增到约250 bp大小的目的片断，阳性率89.29%，见图 4和表 1。23只发病动物中，春季发病的1例、夏季13例、秋季6例、冬季3例；分布滇中8例、滇南8例、滇西7例(图 2，3)。

图 2 狂犬病病毒检测阳性患病动物的季节分布 Figuer 2 Seasonal distribution of sick animals positive for Rabies virus detection

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图 3 狂犬病病毒检测阳性患病动物的地区分布 Figuer 3 Regional distribution of sick animals positive for Rabies virus detection

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图 4 RT-PCR检测狂犬病毒N基因片段部分结果 Figuer 4 Partial results of RT-PCR detection for rabies virus N segments 注：M： DL2000 Marker; 1，3~5： 阴性; 2，6~10： 阳性。

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应用MegAlign软件对测序获得的25份N基因片段序列(217 bp)进行同源性比较，结果它们之间的同源性在91.7%～100%之间。选取其中的3份序列DX01 (来自滇 西地区)、DZ01(来自滇中地区)和DN01(来 自滇南地区)，根据狂犬病毒N基因部分序列，应用 MegAlign软件将测序获得的样本序列(217 bp)与 GenBank中已知参考毒株序列进行同源性比较，结果序列DX01与Yunnan zt07、YN11-02和SCR10-16株的同源性均为99.5%，与Guizhou A148的同源性97.7%，与YNTC06、和CYN1009D的同源性均为91.7%。

序列DZ01与Yunnan zt07、YN11-02和SCR10-16株的同源性均为99.1%，与Guizhou A148的同源性为97.2%，与YNTC06和CYN1009D株的同源性均为92.2%。序列DN01与YNTC06和CYN1009D株的同源性均为99.1%，与02002LAO的同源性97.2%。DX01与DZ01株的同源性均为99.5%，DX01与DN01株的同源性均为91.7%，DZ01与DN01的同源性92.2%。 2.4 系统进化分析

根据狂犬病毒N基因部分序列(217 bp)进行系统进化树分析，结果样本DX01和DZ01均与云南Yunnan zt07、YN11-02和四川SCR10-16株在同一分支内，表明DX01和DZ01均与省外四川SCR10-16株的遗传进化关系较为密切。

DN01与YNTC06和CYN1009D株在同一分支上，表明DN01与YNTC06和CYN1009D株的遗传进化关系最为密切；与东南亚国家病毒株在同一分支之内，表明DN01与东南亚国家毒株的遗传进化关系较为密切，见图 5。

图 5 根据狂犬病毒N基因部分序列构建系统进化树 Figuer 5 Phylogenetic tree of partial segments of rabies virus N gene

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云南省地处中国西南边陲，与缅甸、老挝、越南接壤，与泰国、柬埔寨、印度等东南亚国家毗邻，在国内与贵州、四川、广西等狂犬病高发省(自治区)相邻，从而导致国外和省外狂犬病毒的输入成为可能。目前，云南省狂犬病疫情严重，流行态势较为严峻。掌握狂犬病病原的分布、流行以及病毒的变异特征，将有可能推测出病毒的起源及传播方向，为制定有效的防控措施提供科学依据。狂犬病毒核蛋白(N)基因较为保守，常用于狂犬病的检测及基因分析^{[9, 10]}。本次研究针对N基因对云南省狂犬病进行病毒分子流行病学调查，结果显示本次流行的DX01和DZ01株与国内四川毒株的遗传进化关系较为密切，DN01株与东南亚毒株的遗传进化关系较为密切。表明云南省狂犬病毒起源复杂，可能与云南省所处特殊地理位置有关。

狂犬病毒具有感染一切温血动物的能力，但对各种动物的敏感程度存在较大差异^[5]。在自然界许多家养动物以及鼠类均可感染狂犬病毒，成为传染源^[5]。本次对云南省发病动物和人以及健康犬和鼠类动物进行狂犬病毒调查，结果发现家养动物犬、驴、猪中存在狂犬病毒感染，而鼠类和患者均检测阴性，表明云南省狂犬病的传染源不仅有犬类动物，还可能有其他家养动物。本次调查发现云南省发病动物的带病毒率为43.33%(带病毒的动物分别为驴和猪各1头，其余均为犬)，健康犬中的带病毒率为1.10%，提示犬为本病的主要传染源。带病毒病猪和病驴均被发病的犬咬伤过，说明狂犬病可在家养动物之间传播。

本次调查还发现云南西部、中部和南部地区犬中均存在狂犬病毒，提示云南省狂犬病毒的分布广泛，其病毒来源可能与省外和境外的输入有关。阳性带病毒犬的流动是造成狂犬病的传播和扩散的主要因素，因此该省应加强防止省外和境外阳性带病毒犬的输入以及加强本省家养动物狂犬病的监测工作。

( 志谢： 非常感谢大理、普洱、西双版纳、楚雄、德宏、玉溪、临沧等地区各级CDC相关疾控 人员对样品的采集工作的帮助和支持。)