单纯疱疹病毒性脑炎(herpes simplex virus encephalitis，HSE)是由单纯疱疹病毒引起的一种急性中枢神经系统病毒感染性病变，其对中枢神经系统的损害包括病毒的直接损害和免疫损伤^[1]，其病死率高，后遗症严重，尚无有效的防范措施。病毒感染人体后，是否出现脑炎则存在着个体差异。大量的研究结果证实，人白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)在免疫调节和免疫耐受中发挥重要的生物学作用^[2]，病毒感染时，它可帮助病毒逃避免疫系统监视而长时间潜伏于细胞内。研究表明，HLA-G 第 8 外显子3′非翻译区的14 bp 插入/缺失(ins/del)多态可通过影响可溶性HLA-G的表达而与自身免疫疾病相关^[3]。目前 HLA-G的14 bp 插入/缺多态性与 HSE 发病风险之间的关系尚未可知，本课题就此进行研究。 1材料与方法 1.1研究对象

HSE组：入选了2007 年 1 月至 2012 年 6 月期间在温州医学院附属台州医院神经内科住院的 115 例 HSE 患者，其诊断均符合中华医学会编著的 《临床诊疗指南》中关于急性单纯疱疹病毒性脑炎诊断标准^[4]，并且有相应的实验室和影像学表现(如颞叶的T2高信号病灶)，并由脑脊液聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)确诊(单纯疱疹病毒DNA>500 拷贝/ml)^[5]。 排除标准：(1)伴有恶性肿瘤；(2)伴有自身免疫性疾病或风湿类疾病；(3)伴有细菌性或真菌性感染；(4)继发于中毒、代谢性因素的脑病(如电解质紊乱、低血糖)；(5)发病后已使用糖皮质激素或丙种球蛋白等干扰自身免疫的药物。对照组：同期来该院的健康体检者134 人。两组对象之间一般临床资料相匹配。本研究获得台州医院伦理委员会批准，HSE组及对照组均签署了知情同意书。 1.2方法 1.2.1外周血基因组DNA提取

HSE组和对照组人群均采集乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)抗凝的外周血2 ml。取混匀的全血500 μl，按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司(DNA Blood Kit，目录号GK1042)。提取后的DNA样本分装后置-80 ℃保存备用。 1.2. 2基因型检测

通过PCR扩增的方法检测 HLA-G 基因 14 bp 插入/缺失多态性。PCR反应引物由上海基康生物有限公司合成，序列如下：正向引物 5′-GTG ATG GGC TGT TTA AAG TGT CAC C-3′，反向引物5′-GGA AGG AAT GCA GTT CAG CAT GA-3′。PCR 反应试剂购自上海捷瑞生物工程有限公司。PCR 反应条件：预变性95 ℃ 2 min；循环反应：94 ℃ 45 s，61 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；延伸反应：72 ℃ 5 min。PCR 反应完成后取6 μl产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 ml溴化乙锭)，凝胶成像仪下观察并直接计数14 bp插入/缺失多态性基因型。因为-14 bp缺失的PCR产物片段为210 bp，而未缺失(或插入)的片段为224 bp，因此可直接根据PCR产物片段大小判断检测者基因型。 1.3统计学方法

采用 SPSS 17.0 软件包处理数据，基因型频接受Hardy-Weinberg 平衡检验。两组间基因型及等位基因频率比较均采用χ²检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。 2结果 2.1一般临床资料比较

HSE组共115例，其中男性54例，女性61例，对照组共134人，其中男性66人，女性68人。两组之间性别、年龄、合并疾病等临床资料相比较，差异无统计学意义，P均>0.05，见表 1。

14 bp插入/缺失多态性的PCR扩增结果HLA-G基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，14 bp插入纯合子基因型(ins/ins)或14 bp缺失纯合子基因型(del/del)各在224 bp和210 bp区显示一条条带，而14 bp插入/缺失杂合子基因型(ins/del)则在224 bp和210 bp区均有条带显示，见图 1。

注：1.100 bp的DNA Marker； 5~7、9、11、13、17.ins/del基因型；2~4、10、12、14~16.del/del基因型； 8.ins/ins基因型。 图 1 HLA-G 14 bp基因多态性PCR产物琼脂糖电泳(部分) Figuer 1 Agarose electrophoresis of PCR amplicons of HLA-G 14 bp insertion/deletion polymorphism

图选项

HSE组和对照组中HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性的基因型分布见表 2。两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(HSE组：χ²=3.207 P=0.073；对照组：χ²=0.169，P=0.681)。HSE组与对照组在HLA-G基因14 bp分布总体上差异有统计学意义(χ²=9.87，P=0.007)。将14 bp del作为暴露因素进行分析时发现，HSE组 del/del基因型频率比对照组明显升高(OR=5.56，95%CI：1.15~26.82，P=0.018)，差异有统计学意义。而HSE组ins/del基因型频率与对照组相比差异无统计学意义(OR=2.85，95%CI：0.60~14.0，P=0.295)。

HSE组和对照组及HLA-G 14 bp插入/缺失多态性等位基因频率分布见表 3。发现HSE组14 bp缺失(del)频率较对照组明显升高(OR=1.81，95%CI：1.20～2.71，P=0.004)。

HSE是最常见的中枢神经感染性疾病，约 90% 的HSE是由 HSV-1 感染所引起。中枢神经系统感 染后的免疫反应主要由T淋巴细胞介导。而HSV-1不仅可以通过抑制感染神经元中MHC Ⅰ类分子表达的上调，从而减少 CD⁺₈T 细胞反应的效应，还可以使靶细胞表达MHC Ⅰ类分子失败，从而抑制 CD⁺₈T 细 胞和感染 神经元之间直接相互作用，从而 逃避免疫防御系统。

HLA-G分子是一种非经典的主要组织相容性复合物分子，与机体的免疫调节及免疫耐受密切相关。HLA-G可 以与表达在免疫细胞上 的受体结合 直接发挥免疫抑制功能，同时可以通过诱导产生调节性T细胞或“Trogocytosis”机制参与机体的免疫耐 受^[6]。在病毒感染相关的免疫应答中，HLA-G 可抑制 NK 细胞、CTL 细胞的杀伤能力，抑制TH细胞和树突状细胞的抗原提呈，抑制免疫防御细胞因子的释放，从而导致免疫耐受^[7]。Wiendl 等^[8]发现，在多发性硬化、脑膜炎和阿尔茨海默病例的脑标本，HLA-G 表达较高，提示HLA-G是中枢神经系统的免疫反应调节的基础因素。

HLA-G 基因属于非经典 HLA-Ⅰ b类基因，定位于第 6 号染色体短臂 6p21.3，由 16 个外显子和 7 个内含子组成。与经典的 MHC Ⅰ类分子相比，编码HLA-G的基因多态性相对较少，而且组织学分布局限。在HLA-G 仅证实的 23 个等位基因中，发现第 8 外显子3′端的 14 bp 插入时，HLA-G 的初始转录 mRNA 表达水平降低，从而减少可溶性 HLA-G 分子的表达 。目前 HLA-G 14 bp 插入/缺多态性与 HSE 发病风险之间的关联性尚不明确。

本研究对 115例HSE 患者HLA-G基因14 bp 插入/缺失多态性进行了分析，并以134例正常人为对照，结果发现 HSE 组 del/del 基因型频率为 59.13%，较对照组的 41.04% 明显升高(OR=5.56，P=0.018)。等位基因频率的分析同样发现HSE组 14 bp del 的频率与对照组相比差异有统计学意义(78.70% vs. 67.16%，OR=1.81，P=0.004)。因此，本研究的结果提示 HLA-G 14 bp插入/缺失多态性可 能与HSE的发病相关，其中14 bp 缺失可能是HSE 发病的一个遗传危险因素。尽管目前国内外尚缺乏HLA-G基因多态性与HSE的相关研究。但在肿瘤性疾病的研究中，Eskandari-Nasab等^[11]发现乳腺癌患者HLA-G 14 bp del/del 基因型频率较对照人群明显升高(OR=2.06，P=0.006)，乳腺癌组14 bp del 等位基因频率为56.4%，较对照组46.5% 明显升高，两者相比差异有统计学意义(OR=1.48，P=0.004)。Teixeira等^[12]研究发现肝细胞癌患者HLA-G 14 bp del/del 基因型频率为45%，明显高于对照人群的 35%(OR=1.54，P=0.0871)，肝细胞癌组14 bp 缺失的等位基因频率为65%，而对照组为56%，相比差异有统计学意义(P=0.0326)。本研究所显示HSE组HLA-G del/del 基因型频率及14 bp del 等位基因频率均较对照组高，该结果与上述两项研究具有很好的一致性。此外，在病毒感染性疾病的研究中，王慧燕等^[13]发现HLA-G 14 bp插入/缺失基因型多态性与儿童Epstein-Barr病毒感染的传染性单核细胞增多症的发生有关，携带14 bp del/del基因型或14 bp del等位基因的儿童可能更易发生Epstein-Barr病毒感染。Wang等^[14]研究发现HIV感染的人群中，HLA-G 14 bp del/del 基因型患者与携带14 bp等位基因的患者相比，其病毒载量更高，CD⁺₄T细胞更少，死亡率也更高。上述研究的结果同样提示HLA-G 14 bp 缺失可能与病毒的易感性相关。

综上所述，本研究的结果提示 HLA-G 14 bp插入/缺失多态性可能与HSE的发病相关，其中14 bp 缺失可能是HSE 发病的一个遗传危险因素。虽然其潜在发病机制尚无实验探索，根据以往的研究 ，推测可能是HLA-G基因 14 bp 缺失导致 HLA-G 水平升高，从而增强了免疫抑制，削弱了人体的免疫监视功能，参与HSE的发病。本研究可为HSE的发病提供一个遗传预测因素，但由于存在样本量等方面的局限性，其结果及推测有待后续研究进一步证实。