福氏志贺菌是发展中国家细菌性痢疾的主要致病菌。在中国，福氏志贺菌导致的病例数占细菌性痢疾的80%以上(http：//www.chinacdc.cn/tjsj)。根据O抗结构的差异，福氏志贺菌又分为不同的血清型^[1]。近年来，新的或不能分型血清型不断报道^{[2, 3]}。2000年左右，中国出现一种新的血清型Xv，其分离率逐年升高，并于2002 2006年间取代传统的优势2a血清型，成为中国的优势血清型^[3]。虽然近几年来Xv血清型分离率下降，但是仍处于福氏志贺菌的2~3位^[3]。研究表明，Xv血清型基因组中含有SfX噬菌体基因组，介导在O抗骨架第3个鼠李糖(RhaⅢ)的糖基化修饰，表现为7；8凝集^{[3, 4]}；一个6.8 kb质粒携带的磷酸乙醇胺转移酶编码基因(O-antigen phosphoethanolamine transferase，opt)介导在RhaⅢ或RhaⅡ 3和4位碳原子磷酸乙醇胺修饰，导致MASF Ⅳ-1抗原表位的出现^{[4, 5, 6]}。在血清学和遗传特征上，Xv血清型与X血清型相似，都能与7；8抗血清凝集，区别在于MASF Ⅳ-1凝集^[4]。鉴定Xv血清型需要单克隆抗体MASF Ⅳ-1，价格昂贵，不易获得。因此建立一种快速、特异的Xv血清型鉴定方法，对于福氏志贺菌的检测、监测具有重要意义。

在本研究中，作者根据Xv血清型O抗修饰特征，针对Xv血清型O抗修饰特异基因gtrX、opt及福氏志贺菌O抗合成基因wzx，建立Xv血清型聚合酶链反应(PCR)鉴定方法。 1 材料和方法

1.1 菌株、培养条件和鉴定

福氏痢疾杆菌Xv血清型2002017^[3]作为标准株，用于方法的建立。18株福氏志贺菌其他血清型菌株(表 1)，50株腹泻病相关菌株用于特异性检测。其中宋内志贺菌2株(Ⅰ相和Ⅱ相各1株)，志贺菌12株(1~12个血清型各1株)，鲍氏志贺菌18株(1~18个血清型各1株)，肠聚集性大肠埃希菌2株，肠出血性大肠埃希菌3株，肠侵袭性大肠埃希菌1株，肠致病性大肠埃希菌1株，肠产毒性大肠埃希菌1株，尿路致病性大肠埃希菌1株，大肠埃希菌K12 2株，单增李斯特菌1株，霍乱弧菌1株，副伤寒杆菌3株，猪霍乱沙门菌1株，小肠结肠炎耶尔森菌1株。139株福氏志贺菌临床分离株用于检测，包括1a(4株)、1b(5株)、1c(1株)、1d(8株)、2a(28株)、2b(2株)、3a(4株)、3b(1株)、4a(4株)、4b(4株)、4av(3株)、5a(4株)、5b(1株)、7b(2株)、Xv(38株)、X(18株)、Yv(6株)、Y(4株)、F6(2株)(表 2)。志贺菌常规在LB琼脂平板上、37 ℃条件下培养，挑取单菌落进行群抗原和型抗原的血清学鉴定。

根据已经发表的gtrX^[7]、opt^[4]和wzx^[8]基因序列，采用primer 5.0软件设计引物(表 3)。选择退火温度接近的引物作为备选引物，以方便PCR扩增同时进行。引物由上海生物工程公司合成。

采用水煮法制备DNA用于PCR扩增模板。MPCR按照试剂盒说明进行，反应体系如下：3个基因每条引物终浓度为0.2 μmol/L、1×PCR Master Mix(MPCR反应试剂盒提供)、DNA模板3 μl(1 mmol)，补充蒸馏水至50 μl。PCR 条件为：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。 1.4 PCR扩增产物纯化、测序及序列比对

PCR扩增产物经胶回收纯化后，送上海生物工程公司测序。所测序列与目的基因序列进行比对，以确定扩增产物的正确性。 1.5 临床分离福氏志贺菌菌株血清型的PCR检测

分别选取临床分离福氏志贺菌的不同血清型菌株共139株，按照方法1.3进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断菌株血清型，并与血清凝集鉴定结果进行比较。 2 结果

根据gtrX、opt和wzx基因序列设计引物，以Xv血清型菌株2002017的DNA为模板，首先进行单重PCR扩增。结果发现在1098 bp、782 bp和425 bp位置有相应扩增条带。测序发现扩增产物分别对应opt、wzx和gtrX基因序列。随后进行MPCR扩增。结果发现在50 μl体系中，每条引物终浓度为0.2 μmol/L、1×PCR Master Mix、DNA模板1 mmol，退火温度为55 ℃时，扩增效果最好(图 1)。采用上述MPCR扩增体系，对福氏志贺菌其他18种血清型(1a、1b、1c、1d、2a、2b、3a、3b、4a、4b、4av、5a、5b、F6、7b、X、Yv和Y)进行MPCR扩增。其中wzx基因扩增阳性的福氏志贺菌血清型包括Xv、1a、1b、1c、1d、2a、2b、3a、4a、4b、4b、4av、5a、5b、7b、X、Yv和Y；gtrX基因扩增阳性的福氏志贺菌血清型有Xv、1d、2b、3a和5b；opt基因扩增阳性的福氏志贺菌血清型有Xv、4av和Yv，F6血清型菌株具有独特的O抗合成基因wzx，而且不含任何O抗修饰基因，因此3个基因扩增均为阴性(图 1)。opt、wzx和gtrX基因扩增全部阳性的只有Xv血清型菌株2002017，与其他血清型菌株结果均不同，具有特异性，从而可以用此方法将Xv血清型与其他血清型区别开来。

注：M为DNA DL2000 Marker，从上至下依次为2000、1000、750、500和100 bp。 图 1 福氏志贺菌19个血清型O抗修饰基因MPCR扩增产物 Figuer 1 Multiplex PCR products of O-antigen modification genes of all 19 serotype S. flexneri reference strains

图选项

为检测引物特异性，采用上述体系对50株其他腹泻病相关病原菌菌株进行MPCR扩增。结果显示，在相同的扩增体系和扩增条件下，50株腹泻病相关病原菌菌株的MPCR扩增结果均为阴性，证明引物具有较高特异性。

对139株不同血清型临床分离福氏志贺菌菌株进行MPCR检测，结果发现38株Xv血清型福氏志贺菌的opt、wzx和gtrX基因PCR扩增均为阳性，与Xv血清型菌株2002017一致，血清凝集结果也与MPCR扩增结果完全一致，见表 3；Xv血清型与101株其他血清型福氏志贺菌PCR扩增结果均不同，可以将Xv血清型与其他血清型菌株完全区分(表 3)。 3 讨论

Xv血清型于2000年左右开始在中国出现，其分离率逐年升高，并于2002-2006年间取代中国传统的优势血清型2a，成为优势血清型^[3]。遗传进化和结合试验提示Xv血清型是从X血清型通过获得6.8 kb质粒转化而来^[4]，其与X血清型的唯一区别是RhaⅢ或RhaⅡ 3/4位磷酸乙醇胺修饰，导致MASFⅣ-1抗原表位的出现^[4]。目前鉴定福氏志贺菌血清型主要采用商业化的诊断抗血清与菌株进行 玻片凝集反应，根据免疫凝集结果进行判定。需要群特异性抗血清7；8和单克隆抗体MASF Ⅳ-1结合判断。商业化单克隆抗体MASF Ⅳ-1价格昂贵，基层疾控部门不易获得，限制了其应用；而且血清凝集反应需要分离培养单菌落，反应结果还受到细菌培养条件和生长状态的影响。因此，根据福氏志贺菌Xv血清型O抗修饰及其产生机制，寻找血清型抗原表位特异的分子标识，发展并建立一种快速、特异的Xv血清型分子生物学鉴定方法，对于福氏志贺菌Xv血清型的鉴定具有重要意义。

本研究建立了针对Xv血清型福氏志贺菌O抗修饰基因opt、wzx和gtrX的MPCR鉴定方法。福氏志贺菌O抗合成基因wzx在除6型外的1~5型、7、X及Y型中存在^[8]，可以作为内对照；Xv血清型福氏志贺菌的O抗修饰基因为opt和gtrX，其中opt基因决定了MASF Ⅳ-1抗原表位的修饰，这种修饰作用也存在于4av和Yv血清型中^{[5, 6]}，因此opt基因在这3种血清型扩增为阳性；gtrX基因的糖基化修饰决定了7；8群抗原的出现，这种糖基化修饰也同样发生在1d、2b、3a、5b、X和Xv血清型中，因此这些血清型中gtrX基因扩增为阳性。从PCR扩增结果可以看到，3个基因均为阳性扩增的只有Xv血清型菌株2002017，可以与目前已知的其他18种血清型福氏志贺菌区分开。    本研究建立的福氏志贺菌Xv血清型MPCR鉴定方法具有良好特异性，对50株腹泻病相关病原菌菌株(均为非福氏志贺菌属)进行PCR扩增，结果均为阴性。本研究进一步对139株不同血清型福氏志贺菌临床分离株进行MPCR检测，发现38株Xv血清型菌株的PCR扩增结果与Xv血清型菌株2002017一致，即opt、wzx和gtrX三个基因均为阳性，与其他福氏志贺菌血清型PCR扩增结果均不同，可以将Xv血清型与其他福氏志贺菌血清型完全区分。

本研究建立了一种针对Xv血清型福氏志贺菌O抗原鉴定的MPCR方法，在一个反应中应用3对特异性引物可以将Xv血清型与目前已知的其他18种福氏志贺菌血清型完全区分，结果稳定特异。相比较传统的血清凝集方法鉴定福氏志贺菌血清型，该MPCR方法具有节省时间、判定结果客观、成本较低廉，即使没有昂贵的抗血清也可以实施的优点，而且这也是一可以在任何实验室开展的高通量检测方法。