手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引起的,严重威胁儿童健康的全球性传染病^[1]。手足口病多感染5岁以下儿童，主要表现为口腔黏膜溃疡性疱疹和四肢末端水疱样皮疹，由肠道病毒引起，主要病原为柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16，Cox A16)和肠道病毒71型(Human enterovirus 71，EV71)^{[2, 3, 4]}。近年来，浙江省余姚市手足口病呈波动势态，出现了重症病例和死亡病例。为了解余姚市手足口病的病原构成与Cox A16 VP1基因特征，对该市2010-2012年的手足口病进行了监测与分析，报告如下。 1材料与方法 1.1样品采集

采集余姚市3个监测点医院临床诊断手足口病病例的粪便或咽拭子标本共1651份。粪便标本采集5~8 g放入无菌采便管内，4 ℃冷藏送检，咽拭子用专用棉签采样后装入3~5 ml保存液，4 ℃冷藏送检。 1.2病毒核酸提取

核糖核酸抽提试剂盒由德国QIAGEN生产，按说明书进行操作。 1.3实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，real-time PCR)检测

核酸检测试剂盒(肠道病毒通用型、EV71、Cox A16)采用上海之江生物科技股份有限公司产品。仪器用美国ABI公司7500型real-time PCR仪。每个反应管中加入19 μl荧光PCR检测混合液与1 μl pT-PCR酶，分别加入样品RNA提取液、阳性对照品、DEPC-H₂O各5 μl，将反应管置于real time PCR仪上，45 ℃×10 min；95 ℃×15 min；再按95 ℃×15 s→60 ℃×60 s循环40次；单点荧光检测在60 ℃。扩增Ct≤38，判断为阳性。 1.4Cox A16 VP1基因扩增

引物由上海赛百盛公司合成。根据Cox A16 VP3和2A的守区设计引物Cox A16 VP1 F：5′-CCG CTC AGG ACA ACT TTA-3′和Cox A16 VP1 R：5′-CCA GTC ATT GTG CGT GGC-3′，该对引物可扩增出1046 bp的DNA片段，包括VP1基因全长。RT-PCR扩增采用日本Takela公司的One step RNA PCR Kit(AMV)一步法试剂盒，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)条件为50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s,46 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min 20 s,35个循环；72 ℃ 10 min。取扩增产物10 μl点样于1%琼脂糖凝胶观察是否有预期分子质量大小的条带出现。 1.5序列的测定与分析

利用ABI3730全自动基因测序仪(上海超世公司)对Cox A16 VP1基因直接进行正反核苷酸序列测定。测序结果利用DNAstar和Blast软件进行分析处理。参考株核苷酸和推导的氨基酸序列均来自GenBank。 2结果 2.1病原学检测结果

2010-2012年余姚市3个监测点医院采集的手足口病标本1651份,肠道病毒通用核酸阳性1405份,总检出率为85.10%；其中EV71核酸阳性658份,检出率39.85%； Cox A16核酸阳性427份,检出率25.86%；其 他肠道病毒阳性320份,检出率19.38%，见表 1。经χ²检验，3年之间的 EV71(χ²=26.85，P<0.01)和Cox A16(χ²=40.90，P<0.01)检出率差异有统计学意义,其他肠道病毒差异无统计学意义(χ²=1.06，P>0.5)。

从阳性样品中选取7份Cox A16样品(编号为YY/166/2010,YY/185/2010,YY/201/2010,YY/470/2010,YY/12/2012,YY/32/2012,YY/114/2012)进行Cox A16 VP1基因扩增和核苷酸序列测定。

Cox A16核苷酸序列与台湾和深圳地区流行株的氨基酸序列比对后发现,10株Cox A16 VP1蛋白氨基酸序列相似性为99.3%～100%，见1。2010年的4个分离株与YY/12/2012分离株与1/AUS/99和SZ/HK08序列完全一致,YY/32/2012和YY/114/2012在216位由谷氨酰胺变异为精氨酸(Q→R)，见2。

图 1 7株Cox A16 VP1蛋白与3株代表株氨基酸 序列相似性矩阵表 Figuer 1 Similarity in VP1 protein amino acid sequences of 7 Cox A16 strains and 3 reference strains

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图 2 7株Cox A16 VP1蛋白与3株代表氨基酸序 Figuer 2 VP1 protein amino acid sequences of 7 Cox A16 strains and 3 reference stains

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使用Mega 5.0软件，通过邻接法(Neighbor-joining)，基于全长VP1区基因，以G-10为外类群，对2010-2012年余姚市的7个Cox A16 VP1基因核酸序列和其他代表毒株和流行株进行遗传进化分析，见3，可以看出，2010-2012年余姚市的Cox A16流行株均集中于B1基因亚型进化分支。

图 3 2010-2012年余姚市7个Cox A16流行株VP1基因进化树 Figuer 3 Phylogenetic tree of VP1 gene of 7 Cox A16 strains in Yuyao,2010-2012

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2010-2012年，浙江省余姚市累计报告手足口病确诊患者4490例，年报告发病率分别为124.62/10万、67.05/10万和149.21/10万。病例以散发婴幼儿为主。年发病为单峰型，基本为3月开始病例增多，4 6月发病达到高峰，7月发病逐渐下降， 8 12月发病维持在较低水平。3年来余姚市手足口病的检出率和手足口病的发病率相似，呈非常明显的波动趋势。EV71和Cox A16的检出率各有区别，2011年的EV71检出率最高，占60.28%。Cox A16检出率在2012年最高，占41.93%，2011年最低，占11.35%。2010-2012年余姚市共检测1651份手足口病标本，总检出率为85.10%；其中检出EV71 658份，检出率39.85%；检出Cox A16 427份，检出率25.86%，说明EV71和Cox A16是余姚 市手足口病流行的主要病原体，与目前报道的检出情况基本一致^[5]。比较Cox A16和EV71 引起手足口的人群的特征,无论从发病年龄、男女性别比、职业分布等各方面,两者差异均无统计学意义。说明这2种肠道病毒对不同人群不存在明显的选择易感性。不同年代、不同地区流行优势型别的变迁可能与病毒自身的遗传进化规律及人群的免疫状态有关^[6]。

选取7株Cox A16核苷酸序列与台湾和深圳地区流行株的氨基酸序列比对后发现,10株Cox A16 VP1蛋白氨基酸序列相似性为99.3%~100%，说明余姚市不同年份流行的Cox A16之间以及与台湾和深圳地区的流行株高度同源。系统进化发生树显示，检测到的Cox A16株序列高度一致，2010-2012年的病毒株在进化树上均位于同一分支，表明余姚市的Cox A16来源比较单一，变异较小。

由于Cox A16感染引起的大部分手足口病临床症状较轻，而且多为自限性，所以对Cox A16的流行特征和遗传进化研究相对较少，GenBank中序列信息较少。虽然研究多显示Cox A16引起的手足口病临床症状较轻，但近年来也有该病毒引起心肌炎、心包炎等其他严重疾病的报道^[7]。因此Cox A16基因特征的研究是对该病毒深入研究的基础。Cox A16 VP1基因全长为891 bp,依据目前利用VP1基因全序，Cox A16可分为A、B两个基因型，B基因型进一步分为B1、B2基因亚型。结合本次研究，2010-2012年余姚市的Cox A16流行株均集中于B1基因亚型进化分支，Cox A16感染引起的手足口病也应该引起足够的重视。