疾病监测  2014, Vol. 29 Issue (11): 905-910

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宋秀平, 刘起勇, 栗冬梅, 孙继民, 吴凡, 黄儒婷
SONG Xiu-ping, LIU Qi-yong, LI Dong-mei, SUN Ji-min, WU Fan, HUANG Ru-ting
巴尔通体体外药敏试验方法研究
Comparison of two methods in vitro test of drug susceptibility of Bartonella
疾病监测, 2014, 29(11): 905-910
Disease Surveillance, 2014, 29(11): 905-910
10.3784/j.issn.1003-9961.2014.11.016

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收稿日期：2014-06-20
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宋秀平, 刘起勇, 栗冬梅, 孙继民, 吴凡, 黄儒婷. 巴尔通体体外药敏试验方法研究[J]. 疾病监测, 2014, 29(11): 905-910.
SONG Xiu-ping, LIU Qi-yong, LI Dong-mei, SUN Ji-min, WU Fan, HUANG Ru-ting. Comparison of two methods in vitro test of drug susceptibility of Bartonella[J]. Disease Surveillance, 2014, 29(11): 905-910.
巴尔通体体外药敏试验方法研究
宋秀平1, 刘起勇1, 栗冬梅1, 孙继民2, 吴凡1, 黄儒婷3    
1. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室 世界卫生组织媒介生物监测与管理合作中心, 北京 102206;
2. 浙江省疾病预防控制中心, 浙江 杭州 310051;
3. 北京市丰台区疾病预防控制中心, 北京 100071
收稿日期:2014-06-20
基金项目：重大传染病防治基金资助课题(No. 2008ZX10004-010);国家自然科学基金(No.81101286).
作者简介: 宋秀平,北京市人,硕士,副主任技师,主要从事巴尔通体病原学及分子生物学研究工作
通讯作者：刘起勇,Tel:010-58900738,Email:liuqiyong@icdc.cn
摘要：目的 优化巴尔通体体外药敏试验方法,检测多种抗生素对巴尔通体的最低抑菌浓度(MICs),并分析耐药性.方法 优化Etest法试验条件;将该方法与琼脂稀释法进行比较,评价该方法的可靠性.采用Etest法,检测了7株ATCC参考株对22种抗生素的MICs,数据分析使用SPSS 13.0软件.结果 确定含5%羊血的胰酶大豆琼脂培养基为最佳培养基、2.0 MCF(麦氏浊度)度为最佳细菌接种浓度,7天为最佳孵育时间.测试的7株巴尔通体在体外对强力霉素等13种抗生素敏感(MIC<0.016),对克林霉素等4种抗生素MIC偏高.结论 Etest法简便易行、定值准确、重复性好、结果可靠,可以用于巴尔通体体外药敏试验,并获得了巴尔通体的一些体外药敏数据,为将来制订巴尔通体药敏标准提供一定的依据.
关键词： 巴尔通体     药敏试验     最低抑菌浓度    
Comparison of two methods in vitro test of drug susceptibility of Bartonella
SONG Xiu-ping1, LIU Qi-yong1 , LI Dong-mei1, SUN Ji-min2, WU Fan1, HUANG Ru-ting3    
1. State Key Laboratory for Communicable Disease Prevention and Control, WHO Collaboration Center for Vector Surveillance and Management, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
2. Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310051, Zhejiang, China;
3. Fengtai Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100071, China
Abstract:Objective To establish and optimize the Etest method for the in vitro test of drug susceptibility of Bartonella isolates, detect the minimal inhibitory concentration (MICs) of different antibiotics to Bartonella and analyze the drug-resistant spectrum. Methods The optimum experimental conditions of Etest method were established before detection of MICs. This method was compared with the agar dilution method (the gold standard) to evaluate its reliability. The MICs of 22 antibiotics to 7 reference strains of Bartonella were tested by using the established Etest method, and data were analyzed with software SPSS 13.0. Results The optimum conditions for Etest method in vitro test of the drug susceptibility of Bartonella strains were as follows: The optimum medium was soybean trypsin agar medium containing 5% defibrinated sheep blood; the optimal inoculation concentration was 2.0 MCF; the optimum incubation time was 7 days. Bartonella strains were sensitive to 13 antibiotics in vitro (MIC<0.016), such as doxycycline, azithromycin etc. However, they were non-sensitive to 4 antibiotics in vitro, such as clindamycin. etc. Conclusion Etest method is easy to perform in testing Bartonella strains in vitro, the result is accurate and reliable, and the reproducibility is good, This method can used in in vitro test of drug susceptibility of Bartonella to provide evidence for the development of standards for drug susceptibility of Bartonella.
Key words: Bartonella     Drug susceptibility test     Minimal inhibitory concentration    

巴尔通体(Bartonella)属新发现的能引起动物 及人类不同疾病的微生物，包括22个种及3个亚种[1, 2]，其中已知至少12 种可致人类疾病。巴尔通体引起的疾病，在临床上以猫抓病(cat scratch disease，CSD)较为多见,还与卡瑞恩病、心内膜炎、杆菌性血管瘤和慢性巴尔通体血症等疾病有关。目前对于不太严重的CSD 患者不主张用抗生素治疗,对于较严重的并发视网膜炎或中枢神经系统症状的CSD 患者,可用强力霉素，联合利福平进行治疗[3]。由于巴尔通体的生长条件苛刻和全球分离株少，导致体外敏感性数据非常少。目前已被采用的药敏试验方法包括纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、自动化药敏仪法及Etest方法[4, 5]。国外文献中[6, 7]报道了一些关于采用Etest法进行巴尔通体体外药敏试验的数据，但是试验条件差别很大，使用的培养基种类、细菌接种浓度、接种量、孵育时间也很不一致，国内至今没有该方法的报道。所以现有的药敏数据存在很多问题，很难指导临床用药。因此需要建立巴尔通体最佳体外药敏试验检测方法，对培养基和孵育条件进行标准化，快速、准确检测细菌对抗生素的敏感性,建立菌株的耐药监测，进行耐药性分析，指导临床正规用药。

本研究主要介绍了巴尔通体体外药敏试验方法的建立及评价，7株国际参考株耐药性分析，为今后巴尔通体的耐药性监测提供一个快速高效的检测方法，为巴尔通体的临床治疗提供药敏数据。 1 材料与方法 1.1 实验用菌株

Bartonella henselae(Houston-1)ATCC49882(Bh)、Bartonella elizabethae ATCC49927(Be)、Bartonella bacilliformis ATCC 35685(Bb)、Bartonella grahamii ATCC 700132(Bg)、Bartonella clarridgeiae ATCC 51734(Bc)、Bartonella quintana ATCC VR358(Bq)和Bartonella tribocorum(Bt)(CIP 105476)，共计7株国际参考株。 1.2 质量控制菌株

大肠埃希菌 (E.coli) ATCC 25922、肺炎链球菌(S. pneumoniae)ATCC 49619(CO2培养)由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所微生物室提供，金黄色葡萄球菌(S. aureus) ATCC 29213由诊断室提供。 1.3 试验用抗生素

1.3.1 Etest药敏试纸条

购自兰博瑞公司，瑞典AB Biodisk (Sweden) 公司生产，使用前冻存于-20 ℃。苄星青霉素(PG)(0.002~32 μg/ml)、阿莫西林(AC) (0.016~256 μg/ml)、阿莫西林加克拉维酸钾复合物 (XL)(0.016~256 μg/ml)、头孢噻吩钠(CE)(0.016~256 μg/ml)、 头孢他啶(TZ)(0.016~256 μg/ml)、头孢三嗪(TX)(0.016~256 μg/ml)、亚胺培南(IP)(0.002~32 μg/ml)、妥布霉素(TM)(0.016~256 μg/ml)、丁胺卡那霉素(AK) (0.016~256 μg/ml)、庆大霉素(GM) (0.016~256 μg/ml)、奈替米星(NC)(0.016~256 μg/ml)、红霉素(EM) (0.016~256 μg/ml)、阿奇霉素(AZ) (0.016~256 μg/ml)、克拉仙霉素(CH) (0.016~256 μg/ml)、克林霉素(CM) (0.016~256 μg/ml)、强力霉素(DC) (0.016~256 μg/ml)、环丙沙星(CI) (0.002~32 μg/ml)、复方新诺明(TS) (0.002~32 μg/ml)、利福平(RI) (0.002~32 μg/ml)、磷霉素(FM) (0.064~1024 μg/ml)、多粘菌素B(PO) (0.064~1024 μg/ml)、万古霉素(VA) (0.016~256 μg/ml)，共22种。 1.3.2 琼脂稀释法用抗生素标准品

强力霉素：纯度98.5%,含2%水，Dr.Ehrenstorfer GmbH生产；利福平：纯度≥97%，无水，SIGMA-ALDRICH生产；奈替米星：每mg相当577单位，中国药品生物制品检定所生产；妥布霉素：纯度942 μg/mg,含6%水，SIGMA-ALDRICH生产；丁胺卡那霉素：纯度99%,含8.7%水，Dr.Ehrenstorfer GmbH生产；头孢噻吩钠：纯度 96%～101%，无水，SIGMA-ALDRICH生产；庆大霉素：纯度623 μg/mg，无水，SIGMA-ALDRICH生产。 1.4 方法 1.4.1 实验菌株的复苏及传代培养

取出冻存于-80℃的巴尔通体国际参考株，置于37℃使其完全解冻，用无菌吸管取0.3 ml菌液，加入等体积的胰酶大豆琼脂肉汤稀释，取0.15 ml稀释后的菌液均匀涂布于含5%羊血的胰酶大豆琼脂培养基，待菌液渗入培养基后，翻转平皿，置于5%CO2的37 ℃培养箱培养。培养5～7天后，传代1次。 1.4.2 质控菌株的复苏及传代

取出冻存于-80℃的E.coli 25922、S. aureus 29213和S. pneumoniae 49619置于37 ℃使其完全解冻，取E.coli 25922、S. aureus 29213在MH培养基接种，置于37 ℃恒温培养箱18~24 h，传代1次；取S. pneumoniae 49619接种在含5%羊血的MH培养基上，置于5%CO2的37℃培养箱培养18～24 h，传代1次。 1.4.3 Etest药敏条的准备

将Etest条从-20℃冰箱中取出置室温约60 min,待盒外冷凝水全部蒸发干。用75% 乙醇将Etest接种器等擦拭消毒。 1.4.4 药敏试验菌液制备

巴尔通体分别采用含5%羊血的巧克力培养基和胰酶大豆琼脂培养基,在37 ℃含5%CO2孵箱内孵育。将培养5～7天的巴尔通体，用胰酶大豆琼脂肉汤分别制成不同的细菌接种浓度麦氏浊度(0.5、1.0、2.0、3.0 MCF)的悬浮液，需在15 min内配制好菌液；将培养12 h的E.coli 25922、S. aureus 29213及S. pneumoniae 49619用生理盐水制备成0.5 MCF的菌液，待用。 1.4.5 Etest方法操作程序

将无菌棉签浸入菌悬液中,在管壁上挤干，从3个方向均匀涂布于整个平皿表面。放置15～20 min,用加样器将Etest 条贴放在平皿上。在含5%CO2的37 ℃培养箱培养5～7天后读最低抑菌浓度(MIC)，质控菌株于37 ℃恒温培养箱培养18～24 h判读MIC。检测了B. henselae(Houston-1)、B. grahamii等7株ATCC参考菌株对22种抗生素的MIC,数据录入WHONET软件，数据分析采用SPSS 13.0软件。 1.4.6 琼脂稀释法测定MICs

先将抗生素标准品按要求配成原液，冻存于-20 ℃，临用前再倍比稀释成不同浓度的工作液。将胰酶大豆琼脂培养基高压灭菌，水浴冷却至46 ℃，加入5%去纤维新鲜羊血； 取3 ml倍比稀释好的抗生素工作液，加入到27 ml培养基内混匀后倾倒平板，从低浓度至高浓度配制各种浓度的平板。用无菌棉签刮取培养5～7天的实验菌株,制成0.5、1.0、2.0 MCF的菌悬液。取10 μl菌液接种于各种浓度的平板，置含5%CO2的37 ℃培养箱培养，5～7天后观察结果,记录MIC值。 1.4.7 质量控制

每批实验用E.coli ATCC 25922、S. aureus ATCC 29213及S. pneumoniae ATCC 49619，菌液浓度为0.5 MCF，培养时间为18～24 h，培养时间为5～7 d。质量控制按照CLSI 2012标准，Etest法质量控制按照说明书进行。使用E.coli ATCC 25922做质量控制，MICs分别为AK 1~2(μg/ml)、XL 2~4(μg/ml)、TZ 0.064~0.25(μg/ml)、CE 4~16(μg/ml)、DC 0.5~1(μg/ml)、GM 0.25~1(μg/ml)、IP 0.064~0.125(μg/ml)、NC 0.125~0.5(μg/ml)、TM 0.25~1(μg/ml)、TS 0.064~0.25(μg/ml)、FM 0.5~1(μg/ml)、RI 4~16(μg/ml)；使用S. aureus ATCC 29213做质量控制，MICs分别为CE 0.125~0.5(μg/ml)、DC 0.125~0.5(μg/ml)、AZ 0.5~1(μg/ml)、PG 0.25~1(μg/ml)、CI 0.125~0.5(μg/ml)、CH 0.125~0.5(μg/ml)、CM 0.032~0.125(μg/ml)、EM 0.125~0.5(μg/ml)；使用S. pneumoniae ATCC 49619做质量控制，MICs分别为AZ 0.5~1(μg/ml)、PG 0.25~1(μg/ml)、CI 0.03~0.12(μg/ml)、CH 0.064~0.25(μg/ml)、CM 0.064~0.25(μg/ml)、EM 0.064~0.25(μg/ml)、AC 0.032~0.125(μg/ml)、CL 2~8(μg/ml)、RI 0.016~0.064(μg/ml)、VA 0.125~0.5(μg/ml)。结果按照CLSI 2012标准评价，均在正常范围内。 2 结果 2.1 两种药敏方法测试巴尔通体结果比较

用Bh、Bg两株国际参考株对7种抗生素反复测定5次,结果重复性好,准确度高。对两种药敏方法计算得到的MIC值采用Wilcoxon符号秩和检验，P>0.05(Bh、Bg的P值分别为0.805、0.456)，不能认为两种药敏方法检测结果不同 ，两种方法从MIC值来看同样能够反映细菌的抗生素敏感性,Etest的最低抑菌浓度大约与琼脂稀释法结果的再低一个浓度相近。因此,可以确认两种药敏试验方法可以替代[8]，见表 1。

表 1 Etest 法和琼脂稀释法检测巴尔通体结果比较 Table 1 Comparison of MICs to Bartonella determined by Etest method and agar dilution method
抗生素 Etest MIC(μg/ml) agar dilution MIC(μg/ml)
B.henselae B. grahamii B.henselae B. grahamii
RI0.0030.0120.0080.016
DC<0.016<0.016 <0.016<0.016
GM<0.0160.380 <0.0160.750
TM0.1900.500 0.5001.000
AK0.3803.000 0.5004.000
CE24.00012.000 32.00016.000
NC0.0940.380 0.0640.500
表选项
2.2 两种培养基培养巴尔通体药敏结果比较

分别采用胰酶大豆羊血培养基与巧克力培养基培养Bh和Bg，测定对各种抗生素的MIC，对药敏结果采用Wilcoxon符号秩和检验，P>0.05(Bh、Bg的P值分别为0.197、 0.498)，两种培养基培养结果差异无统计学意义，还不能认为胰酶大豆培养基与巧克力培养基培养效果不同，结合实际培养情况，采用胰酶大豆羊血培养基进行培养。 2.3 细菌接种浓度的分析

对表 2中的AK、CE、TZ、NC、RI、CI、IP、GM、CM、PG、TM、TS、FM、VA的MIC值，采用多组相关连续变量资料的秩和检验(Friedman法)， P<0.05(P=0.007),差异有统计学意义，即对于Bg来说，5个细菌接种浓度对这几种抗生素的MIC值差异有统计学意义。细菌接种浓度为0.5 MCF、1.0 MCF时，如果7 d判读结果，有些抗生素的抑菌环边缘不清晰，结果不易判读，与文献报道一致[9],而当细菌接种浓度为2.0 MCF时，抑菌环边缘清晰，易于判读结果。当细菌接种浓度超过3.0 MCF时，经常会出现假耐药的现象[10]，所以建议最佳细菌接种浓度为2.0 MCF，见表 2。

表 2 B. grahamii不同接种浓度药敏检测结果分析 Table 2 Results of drug susceptibility test of B. grahamii in different inoculation concentrations
μg/ml
抗生素0.5 MCF1.0 MCF2.0 MCF3.0 MCF5.0 MCF
AK3.0003.0003.0004.0002.000
AC<0.016<0.016<0.016<0.016<0.016
XL<0.016<0.016<0.016<0.016<0.016
AZ<0.016<0.016<0.016<0.016<0.016
TZ0.0470.0640.0940.0640.094
CE6.0008.00012.0006.0006.000
NC0.0940.3800.3800.3800.500
RI0.0060.0120.0120.0120.012
CI0.0640.0470.0640.0940.064
FM>1024.000>1024.000>1024.000>1024.000>1024.000
CH<0.016<0.016<0.016<0.016<0.016
EM<0.016<0.016<0.016<0.016<0.016
IP0.0470.0940.1250.1250.125
GM0.3800.2500.3800.3800.250
CM1.0003.0002.0002.0006.000
PG<0.0020.0030.0030.003<0.002
TM0.3800.1900.5000.5000.750
DC<0.016<0.016<0.016<0.016<0.016
TS1.5001.5001.5001.5001.500
VA2.0002.0002.0002.0002.000
PO8.00012.00012.00012.00012.000
TX<0.016<0.016<0.0160.016<0.016
表选项

对表 3的药敏结果，采用多组相关连续变量资料的秩和检验(Friedman法)，P<0.05(P=0.000),差异有统计学意义，即对于Bh来说，5个细菌接种浓度对所有抗生 素的MIC值差异有统计学意 义，根据实际情况，2.0 MCF 为最佳接种浓度，与文献报道一致[9]。

表 3 B.henselae 不同接种浓度药敏结果分析 Table 3 Results of drug susceptibility test of B.henselae in different inoculation concentrations
μg/ml
抗生素0.5 MCF1.0 MCF2.0 MCF3.0 MCF
AK0.0940.1900.3801.000
AC<0.016<0.016<0.016<0.016
CE12.00032.00024.000>256.000
XL<0.016<0.016<0.016<0.016
AZ<0.016<0.016<0.016<0.016
TZ<0.016<0.0160.0470.094
NC0.0230.0160.0940.125
RI<0.002<0.0020.0030.002
CI0.1250.0640.1250.190
FM16.00064.000128.000>1024.000
CH<0.016<0.016<0.016<0.016
EM<0.016<0.016<0.016<0.016
IP0.0940.094>32.000>32.000
GM<0.016<0.016<0.016<0.016
CM<0.0161.0001.0000.500
PG<0.002<0.002<0.002<0.002
TM0.0230.0230.1900.500
DC<0.016<0.016<0.016<0.016
TS>32.000>32.000>32.000>32.000
VA0.5000.7501.0001.000
PO4.0004.0004.0004.000
TX<0.016<0.016<0.016<0.016
表选项

对于Bh这种生长较缓慢的巴尔通体种，对于AK这种抗生素，在细菌接种浓度在0.5 MCF时，MIC值相差高达6个稀释度；对于TZ，在接种浓度0.5 MCF时，MIC值相差4个稀释度；对于CI，在接种浓度0.5 MCF、 1.0 MCF时，MIC值相差5个稀释度；对于IP，在接种浓度0.5 MCF,相差4个稀释度，1.0 MCF时，MIC值相差12个稀释度；对于CM，在接种浓度0.5 MCF时，MIC值相差6个稀释度,在接种浓度1.0 MCF时，MIC值相差9个稀释度;对于TM，在接种浓度0.5 MCF时，MIC值相差5个稀释度,在接种浓度1.0 MCF时，MIC值相差8个稀释度；由此可见，当接种浓度为0.5、1.0 MCF时，结果一致性差；而接种浓度是2.0、3.0 MCF时，除IP外，MIC值相差在3个稀释度内，一致性好，可见对于生长较缓慢的巴尔通体，最佳的菌液接种浓度应为2.0 MCF，见表 3。 2.4 不同种巴尔通体菌株MIC分析

比较不同种巴尔通体菌株MIC，见表 4。从表 4可以看出，CI、CM、 AK对Bq的MIC值偏高；PO对Bt、Be、Bb的MIC值偏高，TS对Bh、Bq、Bc、Bt的MIC值偏高；VA、AK、PO对Bc的MIC值较低； PG、EM、 CH、NC、TM、 AC、 XL、 AZ、 DC、 RI、TZ、TX对所有菌株的MIC值没有明显差别，与文献报道一致[9, 11, 12]。

表 4 不同种巴尔通体菌株MIC Table 4 MICs to different Bartonella speicies
μg/ml
Bartonella speiciesCIPGVAEMCHCMNCGMTM
Bh0.0640.0031.000<0.016<0.0164.0000.0470.5000.064
Bg0.0640.0032.000<0.016<0.0163.0000.7500.3800.190
Bq8.0000.02312.000<0.016<0.01632.0001.0001.0000.500
Bc0.0470.0020.008<0.016<0.0160.0940.0080.0080.008
Bt0.2500.0168.000<0.016<0.01612.0000.7500.5001.500
Be0.1900.0024.000<0.016<0.0162.0000.2500.2500.500
Bb0.0320.00216.000<0.016<0.0163.0000.0470.1250.094
Bartonella speiciesAKACXLAZPOTSDCRITZTX
Bh1.500<0.016<0.016<0.0164.00032.000<0.0160.0030.023<0.016
Bg3.000<0.016<0.016<0.0168.0001.500<0.0160.0120.094<0.016
Bq12.000<0.016<0.016<0.01612.000>32.000<0.0160.0060.750<0.016
Bc0.250<0.016<0.016<0.0160.250>32.000<0.016<0.002<0.016<0.016
Bt8.000<0.016<0.016<0.01624.000>32.000<0.0160.0020.094<0.016
Be3.000<0.016<0.016<0.01624.0001.500<0.0160.0020.125<0.016
Bb3.000<0.016<0.016<0.01624.0000.250<0.0160.0020.016<0.016
表选项
3 讨论 3.1 研究方法小结

本研究在国内首次采用Etest法作为巴尔通体体外药敏试验方法，对多种培养基和多个细菌接种浓度进行了比较，确定含5%去纤维羊血的胰酶大豆琼脂培养基为最佳培养基、2.0 MCF为最佳细菌接种浓度、7 d为最佳孵育时间(与国外文献报导一致[9])。并对Etest 法与琼脂稀释法进行比较,发现Etest法具有操作简便、定值准确、重复性好、结果可靠的优点，可以替代琼脂稀释法作为巴尔通体体外药敏实验方法[13]。 3.2 Etest试验的评价及影响因素 3.2.1 Etest试验的评价

Etest试验是一种直接定量的技术,它结合稀释法和K-B 法的原理特点,克服了上述两种方法的缺点,能直接定量出药物对测试菌的MIC[4]。Etest 法在实验室间具有很高的重复性,其测定的MIC与CLSI规定的标准方法(琼脂稀释法)所得的MIC相关性高，符合率达90%~95%[14] ; 预孵育、预扩散的时间及接种菌量的变异对结果影响很小,简单易行。Erja[15]评价了Etest对真菌的(antimicrobial susceptibility test，AST),认为Etest具有良好的取代肉汤稀释法的应用前景。Yao等[16]评价了Etest对嗜麦芽黄单胞菌的AST，认为Etest是一种可以接受的药敏实验方法。但是,正如文献报道，Etest不适用于生长太缓慢的苛养菌,例如Bartonella. Koehlerae,在血培养基上几乎无法生长，需要在细胞瓶内培养，给贴药敏条造成不便，且该菌的生长时间超过10 d，大部分种类的Etest 条抗生素梯度具有非常好的稳定性[9]，但对于个别抗生素如亚胺培南，与琼脂稀释法结果的相关系数只有0.78[17],这可能与该药不稳定,可以很快降解有关，这类抗生素对生长缓慢的巴尔通体的稳定性还有待继续研究，因此暂时不建议使用Etest方法检测巴尔通体对头孢噻吩钠(CE)、亚胺培南(IP)和磷霉素(FM)的MIC。 3.2.2 Etest试验影响因素

培养基对药敏试验的影响[18]：进行细菌药敏试验所用的培养基种类较多,WHO 要求统一使用Mueller-Hinton琼脂作为常规用培养基。但是,对于某些苛养菌,需要在M-H琼脂中添加其他物质或用其他培养基方可进行药敏试验,巴尔通体是苛养菌，M-H琼脂加入5%去纤维羊血也不能满足其生长，故采用胰酶大豆琼脂培养基加入5%去纤维羊血，国外主要采用巧克力培养基，本实验将两种培养基做了比较，没有显著差异，可以互相替代。MH琼脂平板的厚度要求为4 mm 左右,如果制作平板太厚,抑菌圈会变小,会出现假耐药,若平板厚度<4 mm,抑菌圈会变大,则会出现假敏感,巴尔通体因为生长缓慢，所以琼脂平板厚度要达到6 mm 左右。 3.3 本研究意义

比较了Etest 法与琼脂稀释法两种体外药敏实验方法，明确Etest法优于琼脂稀释法，并且优化了Etest 法的实验条件，为巴尔通体药敏实验方法提供了参考数据，同时检测了7株巴尔通体国际标准株的MICs，为进一步制定标准提供基础。本研究的药敏结果已经输入WHONET软件，现在查询结果非常方便，可以直接查询菌株的MIC值、MIC50和MIC90、以及地区MIC平均值和MIC值范围，尽管现在CLSI还没有巴尔通体的药敏判定标准(近缘菌布鲁氏菌也没有标准[19])，但是本研究的结果会为将来的标准制定提供一定的依据，药敏标准制定后，使用该软件，即可直接比较耐药率、敏感率等指标，对今后的巴尔通体的耐药性监测提供依据。细菌耐药性监测对准确掌握细菌对抗菌药物的耐药动向和耐药性变迁,指导临床合理用药具有重要意义，同时可以用于开展对一些耐药株的药敏监测和新抗菌药物的研究和评估，特别在复发感染的情况下，Etest法是实验室监测耐药变异的简单方法[20] 。

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