胃肠炎是人类最常见的一种疾病，在全球范围内被认为是一个严重的公众健康问题，也是引起婴幼儿发病和死亡的一个主要原因。随着抗生素的广泛应用，人们生活水平的提高，卫生条件的改善，细菌性腹泻得到了有效控制，病毒感染被认为是急性胃肠炎最常见的病原^{[1, 2]}。目前，能引起人类急性胃肠炎的病毒主要包括轮状病毒(Rotavirus，RVs)、诺如病毒(Norovirus，NVs)、星状病毒(Astmvims，AVs)等。这类病毒均具有较强的离体存活力和感染性，一般10～200个病毒粒子即可引发感染^[3]。人体被上述病毒感染后的临床症状相似，主要是呕吐和腹泻，与其他病原造成的胃肠炎症状也难以区别。监测是确定病原体、流行株、发现变异株、预测和防控疫情的基础。因此，为了能够准确、快速地分析并掌握流行概况，筛查可疑病例，明确优势毒株，笔者采用特异性的TaqMan探针，建立了可同时检测轮状病毒A群和星状病毒的双重实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，rRT-PCR)检测方法，并成功应用于临床粪便标本的检测。 1 材料与方法 1.1 病毒株与临床标本

脊髓灰质炎病毒、肠道腺病毒、新肠道病毒68、埃可30、柯萨奇A1以及柯萨奇B5病毒株皆由浙江省疾病预防控制中心(CDC)病毒研究所提供。轮状病毒A群、星状病毒、GⅠ和GⅡ型诺如病毒阳性标本有本中心收集并验证。

收集临床上有水样便至少24 h，伴有恶心、呕吐和发热等症状且被诊断为非细菌性胃肠炎患者腹泻样本128份。粪样收集后在24 h内运回实验室，用病毒采样液 MEM 稀释成10%的悬液，4 ℃、10 000 r/min离心取上清，-20 ℃保存待用。 1.2 主要试剂和仪器

M-MLV反转录酶、dNTP、RNasin、Pgem-T Easy载体试剂盒和 RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 体外转录试剂盒均购自美国Promega公司；病毒RNA/DNA提取试剂为Roche公司生产High Puer Viral Nucleic Acid Kit试剂盒；RNA检测试剂盒：TaKaRa One Step RNA PCR Kit 为宝生物工程(大连)有限公司产品。荧光定量PCR仪：ABI7500 rRT-PCR仪。 1.3  病毒定量标准与病毒核酸提取

分别将轮状病毒A群和星状病毒进行RT-PCR扩增，转化和增菌培养，提取质粒DNA并测序验证。纯化、定量后，作为轮状病毒A群和星状病毒的体外转录标准品。病毒核酸按试剂盒说明书提取。将提取好的核酸进行分装，与-80 ℃冻存，作为RT-PCR模板备用。 1.4 引物与探针设计

选取Noortje等^[4]设计的特异性引物和TaqMan探针，并用Oligo6.0软件对其进行评价。委托宝生物工程(大连)有限公司合成。上游引物(F)、下游引物(R)和探针(P)序列如下：轮状病毒，F1：5′-ACC ATC TTC ACG TAA CCC TC-3′，F2：5′-ACCA TCT ACA CAT GAC CCT C-3′，R1：5′-CAC ATA ACG CCC CTA TAG CC-3′，P1：5′-HEX-CAC ATA ACG CCC CTA TAG CC-BHQ1-3′；星状病毒，F3：5′-TCT YAT AGA CCG YAT TAT TGG-3′R2：5′-TCA AAT TCT ACA TCA TCA CCA A-3′，P2： 5′-FAM-CCC CAD CCA TCA TCA TCT TCA TCA-BHQ1-3′。 1.5 双重rRT-PCR扩增体系和条件

经优化的RT-PCR反应扩增体系：2×RT-PCR buffer 12.5 μl；EX Taq HS 0.5 μl；RT Enzyme MixⅡ 0.5 μl；RVsF1、RVsF2、RVsR、AVsF、AVsR各0.6 μl；RVsP、AVsP各0.3 μl；模板5 μl，DEPC水补足至25 μl。优化后的反应循环条件：42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，共40个循环。在55 ℃进行HEX和FAM荧光检测。 1.6 双重rRT-PCR检测体系的评价

用建立的双重rRT-PCR检测体系对上述10种病毒核酸进行检测，验证体系的特异性。同时对10倍梯度稀释 (10⁷~10¹拷贝/μl)的轮状病毒A群和星状病毒体外转录的标准品平行进行单一rRT-PCR与双重rRT-PCR反应，比较其灵敏度，并构建标准曲线和重复实验验证体系的稳定性。 1.7 临床样品检测

用建立的双重rRT-PCR方法对128份临床粪便样本进行检测，同时用硕世生物科技有限公司生产的轮状病毒A群和星状病毒单重rRT-PCR方法同步进行检测。对阳性样品进行测序验证。 1.8 测序验证

阳性标本经反转录后，进行正反向测序，与美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对验证。序列测定委托宝生物工程(大连)有限公司完成。 2 结果 2.1 方法的特异度

利用建立起的双重rRT-PCR反应体系对10种相关病毒核酸进行检测，其中腺病毒的检测采用TaKaRa公司的Premix Ex Taq^TM(Perfct Real Time)试剂盒。结果显示：轮状病毒A群和星状病毒所在的HEX和FAM检测通道出现相应的特异性荧光扩增曲线，其他病毒均未见扩增曲线。证明检测方法具有良好的特异性。 2.2 标准曲线的建立和敏感性测定

用双重rRT-PCR法分别对10⁷～10¹拷贝/μl的轮状病毒A群和星状病毒体外转录标准品进行定量检测，模板的梯度稀释PCR扩增曲线如图 1～2所示，建立的双重rRT-PCR方法检测轮状病毒最低检出限为10¹拷贝，星状病毒最低检出限为10²拷贝。与单一rRT-PCR方法敏感性相当。将阳性梯度的模板浓度和对应的Ct值进行标准曲线计算，2种病毒对应的标准曲线分别为：轮状病毒：Y=-3.07lgX+40.76，质粒标准曲线的方差系数为0.998；星状病毒：Y=-3.29lgX+41.58，质粒标准曲线的方差系数为0.997，其中Y为对应Ct值，lgX病毒RNA拷贝数的对数值。

注：A.曲线从左到右依次代表浓度,分别为l×107，l×106，1×105、1×104、l×103、1×102、1×101拷贝/μl的标准品。 图 1 双重rRT-PCR检测轮状病毒A群核酸灵敏度和标准曲线 Figure 1 Sensitivity and standard curve of multiplex real-time RT-PCR assay to detect rotavirus group A

图选项

注：A. 曲线从左到右依次代表浓度,分别为l×107，l×106，1×105、1×104、l×103、1×102拷贝/μl的标准品。 图 2 双重rRT-PCR检测星状病毒核酸灵敏度和标准曲线 Figure 2 Sensitivity and standard curve of multiplex real-time RT-PCR assay to detect astrovirus

图选项

取轮状病毒A群和星状病毒的4个不同浓度梯度(10⁶、10⁵、10⁴和10³拷贝/μl)的标准品，分别做3次重复试验，计算各检测项目的变异系数(CV/%)，结果显示各稀释度的3个平行反应获得的Ct值变异系数均在2.0%以下，见表 1。

采用本研究建立的双重rRT-PCR方法对128份临床腹泻标本进行检测，FAM和HEX通道均有扩增曲线，共27份(21.1%)；在HEX通道呈现扩增曲线的为轮状病毒A群核酸阳性，共23份(18.0%)；在FAM通道呈现扩增曲线的为星状病毒核酸阳性，共4份(3.1%)。用各自的单重rRT-PCR方法检测128份临床样本，结果检测到轮状病毒和星状病毒核酸阳性分别为23份和4份，单重和双重rRT-PCR方法检测结果一致。阳性样品经过测序，与NCBI进行比对，结果显示均为轮状病毒A群、星状病毒。 3 讨论

轮状病毒和星状病毒是世界范围内重要的胃肠炎病毒因子。人类轮状病毒A群已被确认为引起全世界婴幼儿急性胃肠炎最常见的原因，每年由轮状病毒引起的腹泻在世界范围内有14亿之多。星状病毒是仅次于轮状病毒引起婴幼儿病毒性胃肠炎的第2位病因，可散发或暴发流行 。由于这类病毒粒子在患者或无症状的携带者的粪便中被大量排放，污染食品、水和生活用品，导致病毒性腹泻的暴发流行，为防止病原更大规模扩散，需要短时间内作出准确诊断，阻断病原的传播。但腹泻病毒的传统检测方法在临床上存在诸多不足^[7]，rRT-PCR技术是采用荧光信号探针与实时定量检测相结合的核酸检测新技术，可对反应体系中的起始模板进行定量^[8]，因其灵敏度高，检测速度快，特异性强等优点，已在诺如病毒等病原体定量检测中得到了广泛的应用^[9]。本研究建立的检测与鉴定轮状病毒A群和星状病毒双重rRT-PCR技术实现一管双检，有效地简化了实验过程，节省了实验试剂。

本研究建立的方法不仅能够在2～3 h内非常准确地检测与鉴定轮状病毒A群和星状病毒，而且与其单一rRT-PCR方法敏感度相当，最低检出限分别可达10¹拷贝和10²拷贝。研究中建立的双重rRT-PCR定量标准曲线相关系数分别达到0.998和0.997，而且，同一稀释度重复3次Ct值的变异系数均>2.0%，说明此反应体系具有很高的精确度和良好的稳定性^[10]。通过对10种相关病毒的检测结果显示，本研究所用的两套引物探针在双重PCR反应体系中无明显交叉反应，具有较好的特异性。

本研究建立的快速、准确、简便的轮状病毒A群和星状病毒双重rRT-PCR检测技术，为病毒性急性胃肠炎引起的腹泻及时防控和治疗赢得了时间，也可以应用于流行病学调查等研究，且双重rRT-PCR技术容易掌握，适合基层单位应用。