慢性乙型病毒性肝炎(乙肝，CHB)是一类与机体的免疫反应密切相关的疾病，细胞免疫功能异常是造成乙肝病毒(HBV)持续感染的主要原因之一^[1]。CD₄⁺T淋巴细胞在抗感染免疫中起核心作用^[2]。近来有学者发现机体内存在着一类新型的不同于辅助性T细胞(Th)1、Th2、调节性T细胞及Thl7等的CD₄⁺T细胞亚群，由于该细胞亚群以主要表达白细胞介素-9(IL-9)为特征，故称作Th9，胞内细胞因子IL-9的表达可以作为检测Th9细胞的标志^[3]。目前Th9与慢性乙肝的发病机制研究较少，本研究拟从Th9细胞及其相关细胞因子IL-9等方面初步探讨Th9细胞在CHB发病中可能的作用。

选择2012年1月至2013年4月在嘉兴市第二医院就诊的慢性乙肝患者53例，其中男性34例，女性19例，年龄范围：23～58岁，平均年龄37.3岁。根据患者血清丙氨酸转氨酶(ALT)的参考值上限(upper limit of normal value，ULN)水平将上述患者分为ALT轻度异常组(ALT 1~2 ULN，n=17)，ALT中度异常组(ALT 2~5 ULN，n=20)，ALT重度异常组(ALT>5 ULN，n=16)。诊断标准符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》^[4]，未接受过抗病毒、免疫调节剂(如糖皮质激素)治疗，无合并甲、丙、丁、戊型等病毒重叠感染，排除酒精性、自身免疫性、原发性肝癌等相关性疾病，无心脑血管、肝、肾和造血系统重大疾病或精神病患者。同时选择健康体检者32名作为对照组，其中男性20名，女性12名，年龄范围：20～52岁，平均年龄34.6岁， 各组年龄及性别差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得嘉兴市第二医院伦理委员会讨论批准。

RPMI 1640培养基购自Gibco公司，APC标记的抗人CD₃、FITC标记的抗人CD₈、PE标记的抗人IL-9流式抗体及其相应同型对照购自BD Parmingen公司，丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、离子霉素购自Sigma公司，莫能霉素购自Bioscience公司，固定剂、破膜剂购自Beckman Coulter公司，人淋巴细胞分离液购自北京索莱宝公司，细胞因子IL-9酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自R&D公司，血清ALT全自动生化分析试剂购自四川迈克生物。

BD FACSCanto 2流式细胞仪购自BD公司，Thermo Multiskan GO全波长读数仪购自Thermo公司，日立7020型全自动生化分析仪购自Hitachi公司。

采集各受试对象早晨空腹静脉血4 ml，其中3 ml置于加入肝素钠抗凝管，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs)，1 ml抗凝全血用于PU.1 mRNA检测，另1 ml全血室温自然凝固后收集上清，取200 μl血清进行ALT检测，ALT参考正常上限值为42 IU/L。其余血清置-80 ℃冷冻保存，用于血清IL-9浓度检测。

将收集的PBMC用PBS洗2次，以RPMI 1640培养基调整细胞浓度为3×10⁶，依次加入PMA(50 ng/ml)、离子霉素(1 μg/ml)及阻断剂莫能霉素(1 μl/1.5 ml)，置于37 ℃，含5% CO₂培养箱培养5 h^[5]。取出后分别加入10 μl APC标记的CD₃和FITC标记的CD₈，避光温育20 min。加入100 μl固定剂，避光温育15 min；PBS洗涤1次，再加入100 μl破膜剂，混匀反应5 min。随后加入10 μl PE标记的抗人IL-9进行胞内染色，同时设同型对照反应管，避光温育20 min后，加入3 ml PBS洗涤2次。弃除上清液，用0.5 ml PBS重悬细胞，进行流式细胞仪测定。本研究以CD₃+CD₈-IL9+T细胞作为Th9细胞。

严格按试剂盒说明书操作步骤将标本稀释成不同浓度加入板条的相应板孔，孵育、洗板、显色后，使用酶标仪A₄₅₀检测吸光度(A)值，通过标准曲线计算标本中的浓度。

采用SPSS 13.0统计软件分析数据。结果以±s表示，两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，相关性分析采用Spearman秩和相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

与健康对照组相比，慢性乙肝组患者外周血Th9细胞比率、IL-9的水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表 1。

表1 慢性乙肝组与对照组Th9细胞及相关因子的检测 Table 1 Th9 cells and related agent detections in chronic hepatitis B group and control group

(±s)
组别	例数	Th9(%)	IL-9(pg/ml)
健康对照组	32	0.33±0.10	82.71±10.55
慢性乙肝组	53	1.02±0.62(1)	184.63±50.32(1)
注：(1)与健康对照组比较，P<0.05。

表选项

研究同时发现，随着ALT水平的增加，Th9细胞比例逐渐升高，IL-9的水平随之增高，3组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表 2。Th9细胞表达百分率与ALT (r=0.637，P<0.05)和IL-9的水平(r=0.817，P<0.01)均呈正相关。血清IL-9的水平与ALT呈正相关(r=0.576，P<0.01)。

表2 Th9、IL-9与ALT的关系 Table 2 Relationship between Th9,IL-9 and ALT

(±s)
组别	例数	ALT(IU/L)	Th9(%)	IL-9(pg/ml)
ALT轻度异常组	17	55.04±8.78	0.42±0.17	104.76±12.42
ALT中度异常组	20	143.67±21.33(1)	1.14±0.33(1)	162.51±47.79(1)
ALT重度异常组	16	700.25±246.89(2)	1.51±0.89(2)	297.14±81.56(2)
注：(1)与ALT轻度异常组比较，P<0.05；(2)与ALT中度异常组比较，P<0.05。

表选项

我国属乙肝高流行地区，约有9300万慢性乙肝感染者^[6]。CHB的发病机制非常复杂，目前仍未完全阐明。多数学者认为HBV感染人体后不直接引起肝细胞损伤，而是与其介导的细胞免疫功能紊乱密切相关^[7,8]。近年研究发现，CHB患者细胞免疫在辅助性T细胞(Th)、细胞因子等多方面均存在异常，并参与乙肝慢性化过程，但CHB患者细胞免疫功能低下的机制尚不明确。Th主要包括Th1、Th2、Th17、Treg以及最新发现的Th9细胞，其中Th1/Th2，Th17/Treg免疫反应失衡在CHB发病过程中的研究相对较多，而对于Th9型细胞在CHB发病过程中的作用则研究甚少。

Th9细胞是一类以分泌大量IL-9为主要特征的CD₄⁺亚群效应性T细胞，由转化生长因子(TGF)和白细胞介素4(IL-4)联合刺激下分化而来，能够促进炎症反应的发生，在炎症疾病、变态反应性疾病和自身免疫性疾病中均发挥着重要作用^[9]。本研究发现，CHB患者外周血Th9细胞的比率较健康对照组显著增多，因此推测Th9可能促进了CHB患者体内炎症的发生，该细胞的增多可能参与了CHB的发病。研究显示，与健康对照组相比较，与Th9细胞密切相关的细胞因子IL-9在CHB患者血清中表达显著上调。IL-9是Th9细胞分泌的主要效应分子。研究发现，由Th9细胞分泌的IL-9作用于不同的炎症细胞，如淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞，使得炎症细胞的数量上升并分泌一些炎症介质，促进炎症的发生^[5,10]。此外，IL-9还可以作用于Treg细胞等效应性T细胞，同时发挥促炎作用从而诱导更加严重的组织炎性反应^[11]。

ALT是肝细胞膜损害的敏感指标，同时也是反映肝脏炎症程度的重要指标^[12]。为进一步研究Th9细胞与肝脏炎症程度的相关性，检测了不同ALT水平下Th9细胞及IL-9的表达情况。结果发现，随着ALT水平的增加，Th9细胞比例逐渐升高，IL-9的水平也逐步上调，并在ALT重度异常组达到最高值，远高于轻度异常组和中度异常组，Th9的表达及IL-9的水平均与ATL呈正相关。提示Th9细胞及其分泌的IL-9不仅参与了CHB的炎症发生发展，而且与炎症程度有一定关联，IL-9的水平检测可作为CHB相关疾病炎症活动的观察指标。

综上所述，以分泌IL-9为主要效应性细胞因子的Th9细胞，参与了CHB的发病，且与CHB炎症程度有一定关联，其机制有待于进一步的研究。以IL-9受体作为靶点，通过调节IL-9的表达来控制CHB的病情进展有望为CHB的治疗带来新的希望。