鲍曼不动杆菌复合群内的细菌是一组非发酵的革兰阴性杆菌，广泛分布在包括水、土壤在内的自然界环境以及人皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中的条件性致病菌，在医院感染中十分常见，可引发呼吸机相关性肺炎、导管相关性血流感染、继发性脑膜炎、泌尿道感染以及伤口感染等^[1,2]。近年来鲍曼不动杆菌复合群细菌对多种临床常见药物的耐药性日益严重，特别是其对β-内酰胺类药物的耐药性在全世界流行，多种超广谱β-内酰胺酶不断在鲍曼不动杆菌复合群细菌中被发现和研究，引起了广泛的关注，给临床抗感染治疗带来巨大的挑战^[3]。

为了解我国海南省鲍曼不动杆菌复合群细菌对临床常用的β-内酰胺类药物的耐药性，本研究收集并挑选了海南省三亚市人民医院2012 2013年非重复鲍曼不动杆菌复合群细菌103株进行7种β-内酰胺类药物的敏感性测定，并对9种分布较广泛的编码碳青霉烯酶的耐药基因进行检测，为了解临床的β-内酰胺类药物的合理使用提供理论数据，为临床鲍曼不动杆菌复合群细菌感染治疗和预防鲍曼不动杆菌感染提供参考。

脑心浸液琼脂培养基购于北京陆桥生物技术有限公司；Mueller-Hinton肉汤培养基购于英国Oxiod公司；抗菌药物标准品粉末哌拉西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、他唑巴坦均购于中国食品药品检定科学院；亚胺培南、美罗培南均购于美国Sigma公司；细菌DNA提取使用QIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒和普通聚合酶链反应(PCR)扩增酶(Taq PCR MasterMix)均购于天根生化科技(北京)有限公司；凝胶回收产物试剂盒(Qiaquick^® Gel Extraction Kit)购于德国QIAGEN公司；测序产物连接试剂盒(pEASY^TM-T1克隆试剂盒)购于北京全式金生物技术有限公司。

103株鲍曼不动杆菌复合群细菌收集于2012年4月至2013年3月不同门诊及住院患者的送检标本，标本包括痰液、尿液、血液、伤口分泌物、切口分泌物、引流物、咽拭子、脑脊液、静脉导管、乳汁多个类型，所有菌株均为不同患者、不同部位的非重复细菌分离株。试验中使用的携带有碳青霉烯酶编码基因的PCR阳性质控菌株均为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所细菌耐药室保存。

应用美国临床和实验室标准协会推荐微量肉汤稀释法对鲍曼不动杆菌复合群细菌进行包括哌拉西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦在内的7种抗菌药物的敏感性测试，以完全抑制细菌生长的最低药物浓度作为细菌最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，每次试验每株细菌进行3个平行的重复试验，每次使用大肠埃希菌ATCC 35218和铜绿假单胞菌ATCC 27853作为质控，当质控菌株的MIC值均在质控范围内时，确定该次试验结果有效质控范围见表 1。当MIC值小于敏感折点判定为细菌对该药物敏感，当MIC值为中介折点值判定为细菌对该药物中介耐药，当MIC值大于耐药折点判定为细菌对该药物耐药。采用CLSI 2014年版标准进行判定^[4]。判定折点及质控菌株MIC值范围见表 1。

受试菌株按照试剂盒按照说明书进行DNA提取，选择与β-内酰胺类药物耐药相关的9种碳青霉烯酶基因进行PCR检测^[5,6]，具体检测基因及PCR退火条件见表 2。使用德国SENSO公司的LabCycler Standard Plus扩增仪进行PCR。所有扩增得到的阳性产物和载体连接后送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，并和GenBank数据库进行Blast比对得到结果。

103株鲍曼不动杆菌复合群细菌对7种β-内酰胺类药物的敏感性测试结果见表 3。表 3表明鲍曼不动杆菌复合群细菌对哌拉西林、头孢他啶、头孢噻肟的耐药率均接近50%，对头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率在40%，对碳青霉烯类药物亚胺培南和美罗培南的耐药率均在20%左右。

本研究选择了在鲍曼不动杆菌复合群细菌中流行的9种碳青霉烯酶编码基因进行检测，其中bla_IMP-1、bla_IMP-2、bla_VIM-1、bla_VIM-2、bla_NDM-1、bla_OXA-23-like、bla_OXA-24-like这7种基因检测结果均为阴性；有38株(37.3%)鲍曼不动杆菌复合群细菌携带有bla_OXA-58-like基因，经Blast对比为bla_OXA-58基因，其中有13株为亚胺培南(美罗培南)耐药或中介耐药菌株，25株为敏感菌株；62株(60.8%)鲍曼不动杆菌复合群细菌携带有bla_OXA-51-like基因，经Blast对比为bla_OXA-66基因，其中有13株为亚胺培南(美罗培南)耐药或中介耐药菌株，25株为敏感菌株；有6株亚胺培南(美罗培南)耐药的鲍曼不动杆菌复合群细菌未能检测到受测的9种碳青霉烯酶编码基因。共有25株(24.5%)同时携带有这两种基因。

本研究共对7种β-内酰胺类药物进行了抗菌药物敏感性测试，结果显示，103株鲍曼不动杆菌复合群细菌对哌拉西林和第三代头孢类药物耐药率接近一半，对哌拉西林/他唑巴坦和第四代头孢类药物头孢吡肟耐药率稍低，对碳青霉烯类药物的耐药率在20%左右。此结果比重庆、上海和广州2009-2011年报道的鲍曼不动杆菌耐药结果低^[1,7,8]。根据CHINET 2012年对我国10省(市)13个医院的临床分离的鲍曼不动杆菌及其复合群细菌的统计分析结果比较^[9]，本研究得到的耐药性结果也略低。

产碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的重要机制。OXA型碳青霉烯酶是Ambler分子结构分类中的D类酶，分为固有型OXA酶(OXA-51-like)和获得型OXA酶(OXA-23-like、OXA-40-like、OXA-58-like及OXA-143-like等)，主要见于不动杆菌属的细菌^[10]，其中bla_OXA-66基因是固有型酶OXA-51-like基因中的一种，bla_OXA-58基因是获得型酶OXA-58-like的一种^[11]。本研究共检测发现bla_OXA-58基因和bla_OXA-66基因呈阳性携带，而且24.5%的菌株同时携带这两种基因。在我国，OXA型碳青霉烯酶在临床分离的鲍曼不动杆菌复合群细菌中十分常见，一般多为bla_OXA-23-like、bla_OXA-51-like、bla_OXA-58-like等基因编码^{[7,11,12,13,14]}，尤其以bla_OXA-23-like基因最常见^[15]。本研究中的产酶鲍曼不动杆菌复合群细菌以携带bla_OXA-58和bla_OXA-66基因为主(分别为37.3%和60.8%)，且bla_OXA-66基因携带率超过60%，但并未发现bla_OXA-23-like基因，与以往文献有所不同^[7,8,13]。如重庆市2009年检测结果显示，bla_OXA-23基因携带率与bla_OXA-51基因携带率均超过70%^[7]。广州市2011年检测的下呼吸道的鲍曼不动杆菌中主要携带的是OXA-23型碳青霉烯酶 ^[8]。山东省2010 2011年分离的鲍曼不动杆菌主要携带的也是OXA-23型碳青霉烯酶 ^[13]。但2014年广州地区研究结果与本研究相似^[16]。基因bla_OXA-66是基因组编码，其所属的bla_OXA-51-like组基因中的不同亚型与鲍曼不动杆菌不同流行克隆可能存在关系，且不通过整合子等移动元件水平转移^[16]，提示该不同的地区、不同分离场所的鲍曼不动杆菌复合群菌株中bla_OXA-66的基因可能有明显不同的分布，本研究中高携带率bla_OXA-66基因的菌株是否和菌株克隆亲缘性有一定关系需要进一步的研究。

携带有碳青霉烯酶基因的菌株数超过亚胺培南和美罗培南耐药的细菌菌株数，与往文献也存在类似情况^[13,14]。有研究显示，OXA型碳青霉烯酶底物谱较窄，产OXA型酶的菌株对第三代头孢菌属类药物可以有轻度耐药性，对亚胺培南的亲和力较高，但水解效能较低，所以菌株的耐药表现有赖于膜通透性的降低以及和其他一些耐药机制的协同作用^[11]。 如有研究提出假说带有OXA型酶编码基因的鲍曼不动杆菌的碳青霉烯酶耐药表型与插入序列ISAbal提供的强启动程序导致碳青霉烯酶的过表达有关^[17]。另外，CLSI对于耐药折点修订对本研究也有一定影响，根据CLSI 2013年判定标准，亚胺培南和美罗培南的中介耐药折点和耐药折点分别为≥2 μg/ml和≥4 μg/ml^[18]，而CLSI 2014年版判定标准分别上升为≥4 μg/ml和≥8 μg/ml，在一定程度人为地影响了耐药菌株的界定，造成部分含有碳青霉烯酶耐药基因的鲍曼不动杆菌复合群细菌可能并没有划归到临床意义上的耐碳青霉烯酶药物菌株中。

在本研究中另有6株亚胺培南(美罗培南)耐药的鲍曼不动杆菌复合群细菌未检测到受测的9种碳青霉烯酶耐药编码基因，这些菌株可能携带有其他并不流行的碳青霉烯酶，需要下一步研究试验进行分析。

综上所述，本研究中收集的103株鲍曼不动杆菌复合群细菌对β-内酰胺类药物耐药性较高，进一步分析得知菌株中存在的bla_OXA-58和bla_OXA-66的基因编码的碳青霉烯酶对菌株的耐药表型有贡献意义，鲍曼不动杆菌复合群细菌中其他的耐药机制也有可能参与到碳青霉烯酶耐药表型的贡献中。β-内酰胺类药物尤其是碳青霉烯类药物是临床抗鲍曼不动杆菌复合群细菌感染治疗中常用的药物，由于目前临床对于耐碳青霉烯类药物的此类菌株治疗手段有限，而编码碳青霉烯酶的基因可以通过耐药菌株或者耐药质粒在同种或不同种细菌间扩散，给临床抗感染治疗带来巨大压力。本研究为调研我国海南地区临床鲍曼不动杆菌复合群细菌的β-内酰胺类药物耐药表型和分析其耐药机理提供了可靠的数据。