诺如病毒(noroviruses，NVs) 又称诺瓦克样病毒(norwalk-like virus)，属于杯状病毒科诺如病毒属。该病毒具有传染性强、发病率高、致病剂量低和抵抗力强等特点，常引起恶心、呕吐、发热、腹痛、腹泻等症状。传染源可以是患者、健康带病毒者和隐性感染者，可通过食物、水以及接触等途径传播，是引起幼儿园、医院、学校等病毒性胃肠炎暴发的重要病原^[1,2]。本研究报道了2014年5 6月间北京市丰台区发生的3起诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情，以了解辖区内诺如病毒流行特征及病原学特点，为今后的防控提供参考。

收集2014年5 6月3起诺如病毒胃肠炎暴发的疫情资料，采集现症患者肛拭子或粪便标本装入无菌盒内，低温送至丰台区疾病预防控制中心(CDC)，-20 ℃保存待检。

将标本制成10％粪便悬液，以8000 r/min离心5 min，取上清液200 μl，参照试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)说明书提取RNA，洗脱体积60 μl，作实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，real-time PCR)和反转录-聚合酶链反应 (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增模板。

使用诺如病毒GⅠ/GⅡ荧光PCR检测试剂盒(江苏硕士)，总体系为25 μl，反应在ABI7500 Fast上进行，条件为50 ℃ 30 min 反转录；95 ℃ 5 min 预变性；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，45个循环。

RNA多聚酶区部分序列扩增使用引物对P289/P290^[3]，上游引物为P289-5′-TGA CGA TTT CAT CAT CMC CRT A-3′，下游引物为P290-5′-GAT TAC TCC AGG TGG GAY TCM AC-3′。试剂采用QIAGEN one step RT-PCR kit，反应体系50 μl，其中5×buffer为5 μl，dNTPs(10 mmol/L)2 μl，Enzyme Mix 2 μl，RNase inhibitor(40 U/μl) 0.25 μl，上、下游引物各2 μl，反应模板5 μl，用DEPC处理水补充至50 μl。反应条件为42 ℃ 1 h 反转录；94 ℃ 15 min 预变性；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min 20 s，72 ℃ 1 min，40个循环；72 ℃ 7 min 延长。取8 μl扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察和照相，诺如病毒条带大小为319 bp。阳性扩增产物外送测序。

使用BioEdit软件进行核酸序列编辑、同源性分析；使用Mega 6.0按照NJ算法构建系统发生树。从GenBank数据库中下载诺如病毒各基因亚型参考株核苷酸序列。

丰台区2014年5 6月间共报告3起聚集性胃肠炎疫情，分别发生在1所幼儿园和2所小学，共发病140例，总罹患率为8.59%，见表 1，无死亡病例。疫情聚集性明显，多发生在同一班级内或相邻班级内。流行时间最短7 d，最长15 d，平均11 d。临床表现以呕吐和腹泻为主，部分伴有恶心、腹痛和发热等症状。病例最小年龄为4岁，最大为12岁。男性患者79例，女性患者61例，男女性别比为1.3 ∶ 1。

在62份患者核酸样本中，36份呈诺如病毒Ⅱ型阳性，阳性检出率为58.06%。

经real-time PCR检测为诺如病毒Ⅱ型阳性的标本，使用引物对P289/P290扩增部分RNA多聚酶区，36份诺如病毒Ⅱ型阳性标本均在319 bp处出现特异性条带。

上述36份阳性样本扩增产物测序后经Blast比对可分为3个基因型。其中幼儿园1获得的13株与GⅡ.7型参考株的核苷酸序列同源性较高达96%~97%，初步判断为GⅡ.7型；13株之间的核苷酸序列同源性在98.5%~100%之间。学校1获得的12株与GⅡ.8型参考株的核苷酸序列同源性较高达94%~96%，初步判断为GⅡ.8型；12株之间的核苷酸序列同源性为98.9%~100%。学校2获得的11株与GⅡ.6型参考株的核苷酸序列同源性较高达96%~98%，初步判断为GⅡ.6型；11株之间的核苷酸序列同源性在98.5%~99.6%之间。

为明确标本的基因分型，从每起疫情的阳性标本中各选取5株和GenBank中下载的参考株构建系统发生树，结果见图 1。图 1可见，15条代表株的核苷酸序列分属于3个不同的进化簇内：其中学校1的代表株BJ14-31-X1/201405、BJ14-33-X1/201405、BJ14-34-X1/201405、BJ14-35-X1/201405、BJ14-36-X1/201405与GⅡ.8型参考株Saitama U25株、 昆明2004年公布的CHN40182株进化距离较近，位于同一进化分支；学校2的代表株BJ14-111-X2/201406、BJ14-114-X2/201406、BJ14-107-X2/201406、BJ14-104-X2/201406、BJ14-106-X2/201406与GⅡ.6型参考株Johannesburg130930株、北京2013年公布的PKUPH-125株位于同一进化分支；幼儿园1的代表株BJ14-3-Y1/201405、BJ14-9-Y1/201405、BJ14-12-Y1/201405、BJ14-20-Y1/201405、BJ14-21-Y1/201405与GⅡ.7型参考株归为同一进化分支。

图 1 北京市丰台区15株代表性诺如病毒RNA多聚酶区核苷酸序列(nt4865~4590)系统发生树 Figure 1 Phylogenetic tree of RNA polymerase region (nt4865-4590) of 15 representative norovirus strains isolated in Fengtai

图选项

诺如病毒根据其衣壳基因序列可分为5个基因组，其中感染人的是GⅠ、GⅡ、GⅣ组；依据病毒部分衣壳及RdRP序列的不同，GⅠ又可分为14个基型，GⅡ可分为17个基因型^[4]。引起的急性胃肠炎 散发病例和暴发事件在世界各国屡见不鲜，GⅡ.4型是流行最广 的基因型，自1993年以来，曾引起各国多起胃肠炎暴发疫情^[5,6]。国内方肇寅等^[7]于1995年首先报道了我国婴幼儿腹泻中有诺如病毒感染，此后的研究表明，我国诺如病毒感染十分普遍，其流行株为GⅡ.4型 ^[8]。随着我国诺如病毒检测技术的发展，近年由NV引起急性胃肠炎暴发的报道增多，尤其是广西、广东、浙江、北京等地。李晖等^[9]对2003 2004年广东省暴发的13起急性胃肠炎检测病原，发现8起由NV引起。

本研究报道了2014年5 6月发生在丰台区2所学校和1所幼儿园的急性胃肠炎疫情概况，使用荧光定量RT-PCR检测方法对采集的62份标本进行核酸检测，初步判断这3起疫情均有GⅡ型诺如病毒引起。然后选用国际上常用的引物对P289/P290对36份阳性标本的RNA多聚酶区进行扩增，经过同源性和系统进化分析发现这3起疫情的病原体可划分为3个不同的诺如病毒基因型，分别为GⅡ.6、 GⅡ.7和GⅡ.8。这是丰台区首次发现由GⅡ.6、GⅡ.7和GⅡ.8型诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情。根据文献报道，GⅡ.4型是全球流行株，也是暴发疫情的常见型别，而由GⅡ.6、GⅡ.7和GⅡ.8引起的暴发疫情国内鲜有报道。方肇寅等 ^[8]报道过北京地区在散发病例中检出GⅡ.6和GⅡ.8型诺如病毒各一例。2007年靳淼等^[10]首次报道了发生在贵州由GⅡ.6型诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情。冯微宏和肖勇^[11]首次报道了2013年无锡由GⅡ.4和GⅡ.7混合感染的暴发疫情。北京地区至今未见关于GⅡ.6、GⅡ.7和GⅡ.8 型诺如病毒暴发疫情的报道。提示诺如病毒在北京地区存在多个基因型别的流行，由于缺乏相关资料，对于各基因型别构成及所占比例尚不清楚，需要加强监测，弄清来源，关注其发展。另外，多个基因型别的存在，为诺如病毒基因组的重组提供了条件，今后的监测还应加强对重组株的甄别。

诺如病毒全年均可发生，冬春季(12月至次年4月)为散发或暴发的高发季节。暴发疫情主要发生在学校、托幼机构、军队等人口密集的地方^[2]，本研究报道的3起疫情发生地点为学校和幼儿园，具有明显聚集性，与报道一致。发生时间均在春末夏初，符合全年均可发生的特点，与李海等^[12]报道一致。研究表明导致诺如病毒胃肠炎暴发的最常见原因是生食被NVs污染的食物，通过密切接触传播 ^[13]。由于实验室检测能力有限，未能找到明确的食源性污染证据。

本研究一方面为丰台区诺如病毒流行特征及病原学特征积累了相关资料，另一方面也为丰台区病毒性腹泻监测工作提出巨大挑战，对于丰台区诺如病毒基因型的构成及流行情况、GⅡ.4是否仍是本区的优势流行株以及各基因型之间会不会出现重组等问题应予以加强，为科学防控提供有力技术支撑。