小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)是一种人畜共患病原细菌，在我国自然界分布广泛，是少数能在冷藏温度下生长的肠道致病菌之一^[1]。该菌除了能引起胃肠道疾病以外，还能引起全身多个系统及器官的症状。我国曾在20世纪80年代发生过2次该菌的暴发，共造成500余人感染^[2]。鼠类作为耶尔森菌属重要的宿主，具有分布广泛，活动性强等特点。有学者认为小肠结肠炎耶尔森菌可以阻止鼠疫耶尔森菌的传播，第3次世界鼠疫大流行日本、欧洲及我国的内蒙古疫源地、甘宁黄土疫源地的流行情况对该理论进行了一定的证实^[3]。云南省作为第3次世界鼠疫大流行的起源地，近年来鼠疫流行处于静息期，鼠疫耶尔森菌分离率很低，这一现象是否与鼠疫疫源地内同一菌属的小肠结肠炎耶尔森菌分布相关。因此调查小肠结肠炎耶尔森菌在云南鼠疫疫源地中的分布，对我国的鼠疫及小肠结肠炎耶尔森菌防制及研究都具有重要意义。

取自2012年5月至2014年4月云南剑川鼠疫野鼠自然疫源地(共8个采样点)鼠结盲肠及舌根样本645份，以及云南梁河家鼠鼠疫自然疫源地(共5个采样点)鼠结盲肠及舌根样本270份，共计915份。

本研究所用的主要试剂有：小肠结肠炎耶尔森菌选择性培养基(OXOID，Yersinia selective agar base)、改良磷酸盐缓冲液(PBS)(Fluka，peptone sorbitol bile broth)、Api 20E生化鉴定条(法国生物梅里埃公司)、分型血清O:5型及尿素培养基(日本荣研化学株式会社)、单克隆抗体(O:9、O:8、O:3均为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所应急实验室研制)、生物分型试剂(丹麦ROSCS公司)、聚合酶链反应(PCR)所有试剂(上海生工生物工程)以及DNA提取试剂盒(天根生化科技)，试剂均在有效期内使用。

取疫源地捕获鼠及自毙鼠舌根及结盲肠部加入到10 ml改良PBS中，4 ℃冷增菌后，分别于第10、21天接种在CIN琼脂平板上，经25 ℃，24～48 h培养后，观察并挑选可疑菌落(边缘透明，边界清晰，中心深红色，成“公牛眼”状菌落)做进一步鉴定。

挑取适量上述可疑菌落对其进行foxA、ail及inv基因的菌落PCR初筛^[4]。PCR反应体系配置：premix 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，纯水10.5 μl。扩增参数：92 ℃预变性5 min；92 ℃变性15 s；foxA 58 ℃、ail 57 ℃、inv 61 ℃退火15 s；72 ℃延伸30 s；25个循环；最后72 ℃延伸5 min，扩增结束后1.5%琼脂糖凝胶(加入Goldview染料，浓度是5 μl /100 ml)电泳，在紫外灯下获取结果，引物及扩增条件见表1。

上述菌落PCR阳性菌用法国生物梅里埃公司生产的Api 20E生化条做生化鉴定。生物分型中1A型大部分为不致病菌株，故可先将疑似菌落挑取少许接种于胆盐-七叶苷平板，置25 ℃，24 h判断结果。

对毒力基因ail、ystA、ystB、yadA、virF及rbfc进行检测^[5]。PCR反应体系配置：premix 12.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，纯水10.5 μl，模板1 μl。扩增参数：92 ℃预变性5 min；92 ℃变性15 s；ystA 61 ℃、ystB 61 ℃、yadA 60 ℃、virF 63 ℃、rbfc 55 ℃退火15 s；72 ℃延伸30 s；25个循环；最后72 ℃延伸5 min，扩增结束后1.5%琼脂糖凝胶(加入Goldview染料，浓度是5 μl/100 ml)电泳，在紫外灯下获取结果。

对符合生化结果及6个毒力基因PCR结果阳性菌株用玻片凝集法对其进行O:3、O:5、O:8、O:9共4个血清分型，同时做生理盐水凝集实验对照。

915份标本中，检出foxA阳性55株，初筛总阳性率为6.01%。剑川、梁河鼠盲肠检出率分别为8.06%(52/645)、1.11%(3/270)(χ²=16.277，P < 0.00)，inv阳性0株，ail阳性1株。

共有34份为小肠结肠炎耶尔森菌，占初筛总菌的61.81%。1份生化鉴定结果为弗氏/克氏耶尔森菌，但ail阳性结果根据16S rRNA基因检测(核糖体分型)及ail毒力基因测序确定其为小肠结肠炎耶尔森菌。所有检出菌均来自剑川，占初筛菌株63.63%。克氏耶尔森1株，产酸克雷伯菌2株，大肠埃希菌1株，肺炎克雷伯菌臭鼻亚种1株，弗氏/克氏耶尔森菌10株，弗氏/中间耶尔森菌1株，见表1。

6株1A/O:5生物血清型占总检出数菌的17.14%，2株1A/O:8生物血清型占总检出数菌的5.71%，1株1A/O:9生物血清型占总检出数菌的2.86%，其余均为生物1A型血清未定型。

35株小肠结肠炎耶尔森菌全部携带毒力基因，包含2个毒力基因型别，其中(ail^-、ystA^-、ystB⁺、yadA^-、virF^-、rbfc^-)毒力基因型别34株，占总检出菌的97.14%；(ail⁺、ystA^-、ystB^-、yadA^-、virF^-、rbfc^-)1株，占总检出菌的2.86%。此次检出菌1株为致病菌，其余全部为非致病菌株，见表2。

耶尔森菌属包含11个菌种，对人致病的菌种有小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌及鼠疫耶尔森菌^[6]。目前关于这3种菌在鼠间是否存在拮抗或替代关系，是鼠疫的静息研究中较为突出的问题^[3]。致病性小肠结肠炎耶尔森菌能够携带一个大小约为70 kb的质粒，通过研究发现该质粒上携带有能够编码一种超抗原的virF基因，这种超抗原可使致病性小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌与鼠疫耶尔菌之间相互阻滞^[7]。此研究检出的小肠结肠炎耶尔森菌均来自剑川野鼠鼠疫自然疫源地所捕获的宿主动物中，而梁河家鼠鼠疫自然疫源地宿主动物中尚未发现小肠结肠炎耶尔森菌。且两地均未检出假结核耶尔森菌，相关文献也证实剑川、梁河近6年均未检出鼠疫菌^{[8, 9]}。此次剑川检出菌株通过毒力基因PCR扩增，均未检出含有virF的毒力基因，由此提示，3种致病性耶尔森菌之间在自然界相互阻滞，除了virF编码的蛋白之外，很可能还存在其他因素。因此剑川分离到非编码virF蛋白的小肠结肠炎耶尔森菌株也可能与鼠疫的相对静息相关。如果上述推断成立，则有助于评估鼠疫疫源地鼠疫暴发的潜在危险性，即未检出小肠结肠炎耶尔森菌的鼠疫疫源地中鼠疫再次暴发的概率将大于检出小肠结肠炎耶尔森菌的鼠疫疫源地。

本次检出菌株均来自剑川野鼠鼠疫自然疫源地，而梁河家鼠鼠疫自然疫源地未检出。出现这种情况的原因可能有：野鼠活动范围广泛，较易接触到被带菌鼠污染的食物；剑川地理环境较为特殊，其位于云贵高原与青藏高原交界处，海拔差较大，蕴藏着丰富的生物多样性，故鼠种分布广泛，微生物也分布较多。这些因素都为小肠结肠炎耶尔森菌的传播创造了良好的条件^[10]。

此次检测1株O:9/1A血清生物型特殊菌株，通过生化鉴定结果显示为弗氏/克氏耶尔森菌，毒力基因检测显示其携带ail基因，但不含有其他毒力基因。通过16S rRNA测序及ail基因测序确定其为小肠结肠炎耶尔森菌(资料正在整理)。小肠结肠炎耶尔森菌的分离培养及鉴定耗时较长，需冷增菌21天再分离培养，纯化后通过生化鉴定判定其是否为该菌，在这个过程中细菌的部分基因可能丢失，其他特性也会被改变，故生化鉴定结果不一定准确。因此在生化结果不确定时可以用高度保守的16S rRNA对其进行鉴定^[11]。

我国目前致病菌株主要分布于O:3及O:9两个血清型^[12]。非致病生物型主要分布于1A型，致病生物型在其他5种型别均有分布^{[13, 14]}。本次检出的35株菌种包含3种以上(O:5、O:8、O:9及未分型)血清型，生物型全部为1A型。毒力基因类型包含(ail^-、ystA^-、ystB⁺、yadA^-、virF^-、rbfc^-)和(ail⁺、ystA^-、ystB^-、yadA^-、virF^-、rbfc^-)2个型别。第一种基因型别共34株为经典非致病株，第二种基因型别为1株。毒力基因ail、ystA、ystB位于染色体上，yadA、virF、rbfc位于70 kb的毒力质粒上(pYV)，通常传统意义上认为丢失质粒的小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因检测结果应为ail⁺、ystA⁺、ystB^-、yadA^-、virF^-、rbfc^-，但本次检出的O:9/1A生物血清型特殊菌不仅有缺失毒力质粒的特征，还缺失ystA基因。因此该株可能是基因缺失株，值得进一步研究。