人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis，HGA)是近年来新发现的一类由嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum，AP)引起的一种重要的人兽共患自然疫源性疾病^[1]。其宿主动物广泛，传播媒介主要为蜱，流行环节复杂。以发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损害为主要临床表现^{[2, 3]}。自美国首次报道病例以来，全球感染该病的数量呈逐年增加趋势^{[4, 5]}。近年来随着临床医生对该病认识的不断提高，我国东北、华中、华南等多个地区陆续发现无形体病疫源地，病例高发地区主要集中在湖北省随州及河南省信阳等地区^{[6, 7, 8]}。云南省是我国媒介传染病高发地区，2009年边长玲等^[9]检测云南西南地区小型兽类嗜吞噬细胞无形体，阳性检出率为4.44%，证明当地野生动物携带有无形体。2010年常利涛等^[10]采用间接免疫荧光法对云南省寻甸、玉龙和思茅3个地区共78份犬血进行嗜吞噬细胞无形体感染调查，阳性率为3.82%(3/78)，说明云南省部分地区犬存在HGA感染。德钦县地处青藏高原的南延部分，横断山脉中段的“三江(怒江、澜沧江、金沙江)并流区”腹地，全境山高坡陡，峡长谷深，地形地貌复杂，为不同种类蜱和宿主动物提供了良好的自然生存环境，为HGA自然疫源地的形成和持续存在提供了客观条件。家犬与人类关系密切，也是HGA的自然感染宿主。为了解德钦县犬嗜吞噬细胞无形体的自然感染状况，本实验采用巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction，nPCR)方法，对该地采集的犬血标本进行无形体属16S rRNA基因检测及分子遗传变异分析，现将结果报告如下。

2013-2014年在云南省迪庆藏族自治州西北部德钦县(E98°36′～E99°33′，N27°33′～29°15′)，海拔(1840～4500 m)区域内约7596 km²范围内的6个乡镇，采用真空采血器采集犬股动脉/静脉血共计315份。其中云岭乡73份、佛山乡73份、升平镇13份、燕门镇58份、羊拉乡28份、霞若乡70份，标本带回实验室进行检测。

用DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit 250；批号20110101)提取犬血块标本DNA，置-20 ℃冰箱保存，备用。

采用nPCR扩增无形体属16S rRNA基因，以Eh-out1和Eh-out2为外引物进行第一轮扩增，再分别以HGA1和HGA2为第二轮扩增的引物进行nPCR扩增。第一轮扩增反应体系如下：DNA模板10 μl，外引物out1(5′-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3′)和out2(5′-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3′)各1 μl，2.5 μl缓冲液，2.5 μl染料，0.5 μl dNTP(10 nmol/L)，0.5 μl TapDNA 聚合酶 (5 U/μl)，无菌H₂O补足25 μl。反应条件为94 ℃预变性5 min，40个循环包括94 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃总延伸5 min。第2轮PCR用第1轮产物，以种特异引物HGA1(5′-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG-3′)和HGA2(5′-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3′)扩增，反应条件同第一轮，扩增产生389 bp片段，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳凝胶成像仪观察结果。每次实验都设立空白和阴性对照，为避免标本污染所造成的假阳性，DNA模板的提取、反应体系的配制、PCR的扩增以及产物的电泳均在不同的房间进行。配样移液枪和加样移液枪也避免混用。

登录NCBI站点，利用BLAST “Sequence Similarity Searching”工具与GenBank中注册基因序列进行同源性比对，选取同源性较大的相应基因序列使用DNASTAR.lasergene.v7.1软件进行同源性分析，使用Mega 6.0软件通过NJ(Neighbor-Join-ing)法构建系统进化树。

共检测犬血样本315份，其中中华田园犬168份，藏犬78份，哈巴犬67份，狼犬2份。通过nPCR扩增无形体16S rRNA片段，315份样本中共检出阳性18份，总阳性率为5.71%(18/315)，其中中华田园犬的阳性率为7.14%(12/168)，藏犬的阳性率为5.13%(4/78)，哈巴犬的阳性率为2.99%(2/67)，见图1。

图 1 嗜吞噬细胞无形体巢式PCR扩增结果 Fig.1 Result of nPCR amplification of 16S rRNA gene of A. phagocytophilum 注：M：DNA Marker； PC：阳性对照； NC：阴性对照； BC：空白对照； 41~810号：阳性扩增产物。

图选项

将20份阳性扩增产物进行测序，其中593和746号测序失败，可能因为获得的DNA浓度不够，其余18份测序成功。将测序成功的序列在NCBI进行Blast比对，分析结果显示当地犬人粒细胞无形体16S rRNA基因序列主要分为2大优势基因群，将其命名为Yunnan HGA1(包括A. phagocytophilum 41、45、99)和Yunnan HGA2(包括A. phagocytophilum 103、119、155、210、278、349、620、747、748、761、769、784、788、791、810)，以其序列为代表的优势流行株分别占检出序列的16.67%和83.33%，见图2。其中Yunnan HGA1与乌拉尔、西伯利亚、远东地区发现的AP序列HM366583以及中国吉林和江苏发现的AP序列DQ342324、JN990105在同一分支。Yunnan HGA2与加拿大发现的AP序列HG916766在同一分支。Yunnan HGA1和Yunnan HGA2均与日本发现的AP序列AB196720、中国浙江发现的AP序列HM439430不在同一分支，且同源性差异较大。说明嗜吞噬细胞无形体的同源性存在一定地域差异。

图 2 嗜吞噬细胞无形体 16S rRNA序列的系统发育分析 Fig.2 Phylogenetic tree of A. phagocytophilum based on partial 16S rRNA sequences

图选项

对所有阳性标本的16S rRNA核苷酸序列与GenBank收录的其他株的系统发生分析结果显示，Yunnan HGA1和Yunnan HGA2的基因片段均与我国吉林、江苏以及加拿大、西伯利亚等地发现的嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因序列的同源性高达99%～100%。与以Yunnan HGA2为代表的15例阳性样本均来自平均海拔为2513～3400 m的云岭乡、佛山乡、升平镇、燕门乡和羊拉乡，采集地点地处横断山脉腹地，沿澜沧江和金沙江河谷分布，也是该地区人口较为集中的区域。经同源分析比较发现该基因型与加拿大发现的AP序列HG916766同源性为99%；而以Yunnan HGA1为代表的3例阳性样本均来自海拔约2282 m的霞若乡，纬度略低于另一个基因群Yunnan HGA2的采集地区，经同源分析比较发现，该基因型与乌拉尔、西伯利亚和远东地区发现的AP序列HM366583同源性达100%，而与中国吉林发现的AP序列DQ342324同源性为99%。

嗜吞噬细胞无形体主要的宿主动物有白足鼠、山羊、绵羊、 犬等^[11]。犬是人类的伴侣动物，也是HGA的自然感染宿主，它能将传播媒介蜱从野外带回，并长期存活，从而导致人被其叮咬甚至感染其携带病原。德钦县位于云南最北端，是少数民族聚集区，主要以藏族、纳西族等为主，住户普遍有圈养犬的习惯，甚至一户多犬，其作用为看家、放牧、狩猎等，与人类接触密切。本次实验从中华田园犬、藏犬、哈巴犬中检出HGA。提示该地区犬存在HGA的感染，可能为人粒细胞无形体病的潜在疫源地，且犬为嗜吞噬细胞无形体储存宿主之一，可能会对人群和家畜的健康产生一定危害。

我国对犬感染HGA的报道较少，本次调查云南省德钦县315份犬血样本中共有18份扩增到目的片段，总阳性率为5.71%(18/315)。其中15份阳性样本均来自海拔较高且人口较集中的地区，与加拿大发现的AP同源性为99%；另外3份阳性均来自低海拔的霞若乡，与西伯利亚和远东地区的AP同源性为90%。提示该地区嗜吞噬细胞无形体的同源性存在一定地域差异，且人粒细胞无形体病多存在于人口密集且海拔相对较高的地方。可能是因为随着人们的生活方式改变以及活动范围的扩大，破坏了蜱的生存环境，造成了疫源地的扩大或出现了新的疫源地。

本研究发现德钦县犬血中存在人粒细胞无形体的感染，提示该地可能为HGA的潜在疫源地，需进一步开展媒介蜱种类及人群和家畜等相关宿主动物与无形体生态关系以及流行株分子流行病学特征研究，尤其是开展发热患者人粒细胞无形体病实验室检测，同时加强科普宣教，提高实验室检测能力，预防相关疾病的发生。