柯萨奇病毒是单股正链RNA病毒(Picornaviridae)，属于小RNA病毒科肠道病毒属(Enterovirus)^[1]。柯萨奇病毒型别较多，其中A组共有21个血清型，属于A组肠道病毒的有CVA2，3，4，5，6，7，8，10，12，14和16，属于B组肠道病毒有Cox A9，属于C组肠道病毒的有CVA1，11，13，17，19，20，21，22，24。 柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16，Cox A16) 和人肠道病毒71型(Human Enterovirus A71，HEV-A71) 是引起儿童手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)的主要病原^{[2, 3]}。与引起HFMD的重要病原HEV-A71相比，Cox A16感染通常不引起严重的中枢神经相关疾病^{[2, 4]}。但近年来越来越多的研究表明，Cox A16感染与心肌炎、心包炎及其他严重疾病相关，逐渐受到重视。本研究选取2008-2013年浙江省分离到的Cox A16毒株的VP1区进行分析和研究，并对此进行了流行病学调查，对患者标本进行病毒分离、鉴定，并对部分分离毒株进行了VP1区核苷酸序列比较与分析，现将结果报道如下。

标本由本省各地市疾病预防控制中心(CDC)上送，临床诊断为疑似手足口病患者。按照卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2009版)的要求上送标本。浙江省CDC病毒实验室2008-2013年共收到全省各地市CDC上送手足口病标本共2708份左右，包括粪便标本、咽拭子和含漱液。

对上送的1538份标本使用人横纹肌肉瘤细胞(RD)和非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离，按照《手足口病预防控制指南》(2009版)肠道病毒分离操作规程进行^[5]。如果出现人肠道病毒HEV特异的细胞致病变效应(CPE)，则冻存于-80 ℃备用。

按照卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2009版)，使用HEV通用引物，HEV-A71和Cox A16引物对病毒分离物进行鉴定。病毒RNA的提取采用QIAGEN公司的Rneasy mini Kit，按照试剂盒说明书操作。RT-PCR采用日本TaKaRa公司的一步法RNA PCR(TaKaRa One step RNA PCR Kit) 试剂盒进行，操作按试剂盒说明书。反应条件：50 ℃ 30 min反转录，94 ℃ 预变性2 min，94 ℃ 变性30 s，50 ℃ 退火60 s，72 ℃ 延伸60 s，40个循环，72 ℃ 延伸10 min，然后转入4 ℃。取扩增产物5 μl，用1.5％琼脂糖电泳，根据DNA标准分子质量(Marker)位置对扩增片段进行确认。

将鉴定为Cox A16的病毒分离物进行全长VP1区基因扩增，引物序列由中国CDC国家脊灰实验室提供。上游引物Cox A16- VP1-S(5′-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3′)和下游引物Cox A16-VP1-A(5′-GCT GTC CTC CCA CAC AAG AT-3′)，RT-PCR采用日本TaKaRa公司的一步法RNA PCR 试剂盒进行，操作按试剂盒说明书。

扩增阳性的RT-PCR产物送上海英骏生物技术公司进行序列测定；使用BioEdit及Mega 6.0等软件进行分析(Sudhir Kumar，Arizona State University，Arizona，USA)，建树的可靠性通过1000 bootstrap来评估。用于构建系统发生树的Cox A16各基因型代表株的参比序列来自NCBI的GenBank。

对2008-2013年收到的1538份手足口病标本进行了病毒分离。共分离到539株病毒分离物。

对上述所有阳性分离株进行RT-PCR鉴定，鉴定结果为HEV-A71共323株，Cox A16共154株，其他肠道病毒62株。

为了进一步了解Cox A16的VP1区基因特征，对鉴定为Cox A16的病毒分离物选取其中81株(包括不同地区的轻症共 74 株、重症5株、死亡2株)。用RT-PCR进行全长VP1区域基因扩增。

对81株Cox A16毒株进行VP1区核苷酸序列测定和分析，结果显示81株Cox A16的VP1区核苷酸长度都是891个核苷酸，编码297个氨基酸。并与基因数据库(GenBank Database)检索到的Cox A16各个基因型及亚型代表株的VP1区核苷酸序列进行同源性分析。结果表明：本次研究的81株Cox A16分离株VP1区的核苷酸和氨基酸存在着一定的差异，分别是88.7％～100％和97.8％～100％。与国际标准株G10-A基因型代表株的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为 61.9％～65.1％和90.1％～91.7％。这81株Cox A16 分离株都属于B基因型的B1基因亚型。与B1基因亚型代表株的核苷酸和氨基酸同源性最高，分别为89.2％～97.9％和98.6％～100％。

用Mega 6.0软件对分离到的81株Cox A16分离株与取自GenBank的其他各个基因型、基因亚型的Cox A16代表株进行遗传进化分析。进化树显示所有Cox A16代表株分为2个不同的基因型，即A基因型和B基因型^[4]。这与国内外研究的结果一致。Cox A16的原型株(G-10/RSA/1951)是唯一的A基因株，与其他的Cox A16株有着较明显的差异。

图 1 浙江省81株Cox A16分离株VP1区核苷酸序列进化分析 Fig.1 Phylogenetic tree of 81 Cox A16 strains based on complete nucleotide sequences of VP1 region gene

图选项

图1表明浙江省2008-2013年分离的81株Cox A16均属于B1基因型。其中62株与B1基因型的B1b同源性较高，另19株与B1a的同源性较高，说明81株Cox A16分离株分别属于B1基因型中的B1a和B1b两大进化分支。每个分支中包含了浙江省各个地区和各个年份的Cox A16毒株，说明目前有两条进化分支在浙江省各个地区共同循环^[5]。

其中又以B1b分支为主，在2010-2013年分离到的62株Cox A16 B1毒株中有49株为B1b，说明近几年B1b基因亚型株比较活跃。两大进化分支与我国其他省份及周边国家流行的Cox A16亲源关系也较接近，提示Cox A16在中国大陆传播时间较长。在这81株分离株中重症病例株和死亡病例株与其他轻症病例株相比较氨基酸和核苷酸同源性无明显差异。

手足口病及相关临床综合征是危害儿童健康的重要疾病。Cox A16和HEV-A71是引起手足口病的主要病原体，不同基因型或基因亚型的Cox A16和HEV-A71交替循环或共同循环于东亚和东南亚地区，导致近20年手足口病在该地区反复流行^[6]。

Cox A16是引起心肌炎和心肌病的重要病原，但由于其亚临床感染常被忽略。自从1951年在南非分离到Cox A16以来，其流行范围已遍布全球。在世界范围内对有关Cox A16的流行病学和分子基因研究报道相对较少。我国自1999年起展开对Cox A16的研究。Cox A16的基因组仅有一个开放读码框架(ORF)，VP1编码区全长891个核苷酸，编码含297个氨基酸残基的VP1结构蛋白，具有与病毒血清型基本对应的遗传多样性。很多研究表明，VP1区的核苷酸序列可作为HEV血清型鉴定和基因分型的依据。本研究分析Cox A16分离株的VP1编码区基因特征。

为分析浙江省手足口病患者中分离到的Cox A16 VP1基因变异和进化关系，笔者对2008-2013年浙江省不同地区分离到的81株Cox A16通过RT-PCR进行了VP1的扩增和测序，并与国内外Cox A16进行比较分析。81株Cox A16的VP1区编码基因均为891 bp，相互之间的核苷酸和氨基酸的同源性存在一定的差异，分别为88.7％～100％和97.8％～100％。Cox A16分为A和B两个基因型，G-10/RSA/1951是Cox A16 的原型株，是A基因的唯一成员。B基因可分为B1和B2基因亚型。B2基因亚型为代表早期流行的Cox A16株(1981-2000年)，B1基因亚型在2000年之后逐渐取代B2 基因亚型，成为近期的流行优势株，浙江省2008-2013年分离到的这81株毒株都属于B1基因亚型，与文献报道相符。

尽管Cox A16在全世界范围内广泛流行，但与HEV-A71相比，Cox A16相对保守，VP1区的序列变异较小。只进化为2个基因型A、B。但近年来，有Cox A16引起的重症手足口病和甚至引起死亡的病例也不少见，所以建立Cox A16毒株资源库和基因资料，对于监测中国所流行的Cox A16基因型的分布和病毒的分支特征具有重要的意义。自2008年5月手足口病纳入法定传染病以来，浙江省手足口病疫情连续呈现高发态势，Cox A16和HEV-A71在浙江省不同地区交替循环。本研究对浙江省2008-2013年的Cox A16分离株进行了VP1区的特征分析，了解了该省的Cox A16的基因特征及与周边国家和我国其他地区Cox A16的基因亲源关系及变异情况，对浙江省手足口病的防控提供了基础资料。