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文章信息
- 徐丽, 朱兵清, 徐征, 高源, 邵祝军
- XU Li, ZHU Bing-qing, XU Zheng, GAO Yuan, SHAO Zhu-jun
- 2003-2012年中国部分地区脑膜炎奈瑟菌体外抗生素敏感性分析
- Analysis on antibiotic susceptibility of Neisseria meningitidis isolates in China,2003-2012
- 疾病监测, 2015, 30(4): 316-320
- Disease Surveillance, 2015, 30(4): 316-320
- 10.3784/j.issn.1003-9961.2015.04.017
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文章历史
- 收稿日期:2014-10-21
脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,Nm)是引 起细菌性脑膜炎的主要病原菌,其主要毒力因子是荚膜多糖,有12种荚膜多糖血清型(A、 B、 C、 H、 I、 K、 L、 X、 Y、 Z、 W135 和29 E),90%的流行性脑脊髓炎(流脑)病例是由A、B和C群菌株引起[1],历史上曾引起2次流脑的世界大流行[2]。流脑暴发时对患者和高危人群应急使用抗生素是降低死亡率和控制流脑传播的重要措施,但常常由于细菌的耐药性而导致预防和治疗的失败,监测临床治疗失败病例和检测流行的Nm是发现耐药菌株的重要途径。
近几年来,我国加强了对Nm的抗生素耐药性监测,本研究室长期进行Nm菌株抗生素敏感性检测,对我国2003-2005和2008-2009年度Nm菌株的抗生素敏感性检测结果也曾有过报道[3, 4],但由于Nm菌株的耐药性在不断发生变化,因此,对Nm菌株进行抗生素耐药性检测和监测,及时了解我国Nm的耐药性变迁情况,为临床治疗用药和预防性服药提供实验室依据尤为重要。本研究根据临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐标准[5],采用微量肉汤稀释法和E-test浓度梯度扩散法,对2003-2012年自我国29个省(直辖市)的患者及健康携带者分离的487株Nm菌株,进行了抗生素体外敏感性检测,以观察Nm耐药谱的变化趋势。
1 材料与方法 1.1 菌株收集本研究共收集自2003-2012年中国29个省(直辖市)分离的487株Nm菌株,其中190株为患者菌株,包括73株A群、15株B群、93株C群、8株W135群和1株X群;297株为健康携带者菌株,包括29株A群、61株B群、102株C群、24株W135群、7株Y群、3株X群、1株I群、7株29E群和63株不可分群菌株。菌株年代及血清群分布,见表1。
年份 | 血清群 | 总计 | ||||||||
A | B | C | W135 | Y | X | I | 29E | NG | ||
2003 | 30 | 30 | ||||||||
2004 | 6 | 6 | ||||||||
2005 | 31 | 70 | 101 | |||||||
2006 | 24 | 20 | 32 | 1 | 5 | 82 | ||||
2007 | 27 | 19 | 10 | 1 | 3 | 2 | 4 | 9 | 75 | |
2008 | 7 | 11 | 17 | 6 | 2 | 1 | 2 | 12 | 58 | |
2009 | 6 | 6 | 11 | 8 | 2 | 1 | 1 | 30 | 65 | |
2010 | 5 | 3 | 5 | 1 | 14 | |||||
2011 | 1 | 14 | 9 | 11 | 1 | 4 | 40 | |||
2012 | 1 | 3 | 5 | 5 | 2 | 16 | ||||
合计 | 102 | 76 | 195 | 32 | 7 | 4 | 1 | 7 | 63 | 487 |
革兰染色试剂盒(美国Remel公司);生化鉴定用奈瑟球菌和嗜血杆菌鉴定试剂盒(API NH)(法国生物梅里埃公司);Nm分群用抗血清(美国Remel公司);PCR引物由生工生物工程(上海)公司合成;DNA提取纯化试剂盒(美国QIAGEN公司);PCR扩增仪为Bio-Rad DNA Engine;凝胶成像仪为Bio-Rad Geldoc XR。
1.3 药敏试验用试剂根据CLSI标准,选用12种抗菌药物环丙沙星、利福平、复方新诺明、米诺环素、萘啶酸、美罗培南、阿奇霉素、头孢曲松、氯霉素、头孢噻肟、青霉素和氨苄西林,E-test试纸条为法国生物梅里埃公司产品;微量细菌定量药敏(MIC)测试盒(天津市金章科技发展有限公司);培养基为添加5%羊血的Mueller-Hinton(M-H)琼脂平板,厚度4 mm,PH7.2-7.4(英国OXOID品牌);CAMHB稀释肉汤(英国OXOID品牌);质控菌株为S.pneumoniae ATCC 49619和Escherichia coli ATCC 25922。
1.4 菌株鉴定 1.4.1 细菌形态鉴定采用革兰染色法,参照试剂盒说明书操作,染色后在显微镜100倍油镜下观察细菌形态,呈红色是革兰阴性菌,呈紫色为革兰阳性菌。
1.4.2 生化反应鉴定使用API NH试剂盒检测,参照试剂盒说明书操作,根据颜色变化对应说明书中结果判读表,在结果报告单上记录结果,每株菌均获得一组4位数编码,将此编码输入数据库(V3.0)自动判读结果。
1.4.3 聚合酶链反应(PCR)扩增特异性核酸片段收集哥伦比亚血平板上的新鲜菌苔,用QIAGEN试剂盒提取染色体DNA,通过PCR检测crgA和sodC基因。每个PCR反应体系总体积为20 μl,上下游引物浓度均为0.5 μmol/L。反应条件为95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,55 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸30 s,30个循环;终末延伸72 ℃ 5 min。PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪读取结果。如果扩增出的片段清晰可见且符合crgA(230 bp)和sodC(282 bp)片段长度即鉴定为Nm菌株。
1.4.4 血清群鉴定采用玻片凝集试验,在洁净玻片上,取Nm培养物分别与生理盐水和Nm各分群血清混合,轻摇玻片1~2 min后观察结果,如液体呈均匀乳浊状为不凝集,如出现凝集颗粒,液体变清亮为凝集反应,只与一种分群血清凝集而不与生理盐水凝集即可定为该血清群的Nm,与任何一种分群血清和生理盐水均不发生凝集或与几种分群血清都发生凝集即判断为不可分群Nm。
1.5 E-test浓度梯度扩散法参照E-test试纸条说明书操作,经鉴定后的Nm传种在含有5%羊血的M-H琼脂平板上,于35~37 ℃ 5% CO2孵育20~24 h,挑选典型菌落转种在含有5%羊血的M-H琼脂平板上,于35~37 ℃ 5% CO2孵育20~24 h,用无菌棉拭子刮取新鲜菌苔,浸入无菌的CAMHB稀释肉汤(用前加热到35 ℃)制成0.5麦氏单位的菌悬液,用无菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布在含5%羊血的M-H琼脂上3次(每次将平板旋转60°,使用一个棉拭子不再蘸取菌液),静置5~10 min使平板表面的菌液干燥,用无菌镊子将E-test试纸条(用时温度达室温)放在平板上,于35~37 ℃ 5% CO2孵育18~22 h后记录结果。同时用ATCC 49619和ATCC 25922做质控对照,读取抑菌环的边缘与试条交界处的数值即为该抗菌药物对受试菌的最低抑菌浓度(MIC)质控菌株及被检菌株的结果判断均根据所读取的MIC值参照CLSI推荐标准报告其R(耐药)、I(中介)和S(敏感)。
1.6 微量肉汤稀释法参照微量细菌定量药敏(MIC)测试盒操作,经鉴定后的Nm传种在含有5%羊血的M-H琼脂平板上,于35~37 ℃ 5% CO2孵育20~24 h,挑选典型菌落转种在含有5%羊血的M-H琼脂平板上,于35~37 ℃ 5% CO2孵育20~24 h,用无菌棉拭子刮取新鲜菌苔,浸入无菌的CAMHB稀释肉汤(用前加热到35 ℃)制成0.5麦氏单位的菌悬液,40倍稀释后接种到96孔药敏板中(100 μl/孔),盖上无菌盖,于35~37 ℃ 5% CO2 孵育18~22 h,读取结果以在孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC值,根据所读取的MIC值参照CLSI推荐标准报告其R、I和S。
1.7 统计学分析所有数据录入Excel软件,进行百分比、比例等描述性分析。
2 结果 2.1 鉴定结果 2.1.1 细菌形态鉴定487株菌株经革兰染色,镜下观察呈红色,形态均成双排列,经鉴定均为革兰阴性双球菌。
2.1.2 生化反应将487株菌经API NH检测的结果编码全部输入数据库(V3.0),判读结果均为Nm。
2.1.3 PCR检测结果487株菌经PCR方法检测crgA(230 bp)和sodC(282 bp)基因均为阳性,可判断为Nm。
2.1.4 血清群鉴定487株Nm和分群血清经玻片凝集反应,只与一种分群血清发生凝集反应的有A群102株、B群76株、C群195株、W135群32株、Y群7株、X群4株、I群1株和29E群7株;其余63株为不可分群菌株。
2.2 487株Nm菌株对不同抗生素的敏感性所有487株Nm菌株对头孢噻肟、头孢曲松、阿奇霉素、美洛培南、氯霉素和米诺环素均100%(487/487)敏感,75.6%(368/487)的菌株对萘啶酸耐药,87.1%(424/487)对复方新诺明耐药,48.9%(238/487)对环丙沙星耐药,另有4.9%(24/487)和3.5%(17/487)的菌株分别对青霉素和氨苄西林不敏感。2004年前收集的菌株仅对萘啶酸和复方新诺明有耐药性,耐药率分别为75%(27/36)和86.1%(31/36),2005年的菌株中除对萘啶酸和复方新诺明保持较高的耐药性外,还出现了23.8%(24/101)对环丙沙星耐药的菌株,从2006年开始出现对青霉素类药物不敏感菌株,82株菌株中对青霉素和氨苄西林不敏感的菌株均为2株(2.4%)。2007-2012年分离的菌株均对萘啶酸、复方新诺明和环丙沙星保持着较高的耐药性,对青霉素和氨苄西林的不敏感菌株也逐年增多,2012年的不敏感菌株分别占当年分离菌株的12.5%(2/16)和6.2%(1/16),但没有出现耐药菌株。
2.3 不同血清群菌株的抗生素敏感性各血清群菌株对萘啶酸、复方新诺明和环丙沙星均有不同程度的耐药,对复方新诺明的耐药率最高,其中Y群、X群、I群、29E群和不可分群菌株全部耐药,C群耐药高达92.3%(180/195),A群对萘啶酸的耐药性最高达95.1%(97/102),1株I群对萘啶酸表现耐药。除Y群和I群以外,其他各群菌株对青霉素和氨苄西林均有不敏感菌株,但没有耐药菌株出现,见表2。
血清群 | 菌株数 | 敏感性 | 萘啶酸(%) | 复方新诺明(%) | 环丙沙星(%) | 青霉素(%) | 氨苄西林(%) |
注:(1)以百分比表示菌株对抗生素敏感和耐药比例,“R”表示对抗生素耐药,“I”表示对抗生素敏感性处于中介,“S”表示对抗生素敏感,“NG”表示不可分群。 | |||||||
A | 102 | R | 95.1 | 76.5 | 74.5 | 0.0 | 0.0 |
I | 0.0 | 23.5 | 20.6 | 2.0 | 2.9 | ||
S | 4.9 | 0.0 | 4.9 | 98.0 | 97.1 | ||
B | 76 | R | 51.3 | 96.1 | 47.4 | 0.0 | 0.0 |
I | 1.3 | 2.6 | 2.6 | 9.2 | 5.3 | ||
S | 47.4 | 1.3 | 50.0 | 90.8 | 94.7 | ||
C | 195 | R | 82.6 | 92.3 | 34.4 | 0.0 | 0.0 |
I | 7.7 | 4.6 | 44.1 | 1.5 | 0.5 | ||
S | 9.7 | 3.1 | 21.5 | 98.5 | 99.5 | ||
W135 | 32 | R | 43.8 | 34.4 | 40.6 | 0.0 | 0.0 |
I | 0.0 | 3.1 | 3.1 | 12.5 | 6.2 | ||
S | 56.2 | 62.5 | 56.3 | 87.5 | 93.8 | ||
Y | 7 | R | 28.6 | 100.0 | 28.6 | 0.0 | 0.0 |
I | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | ||
S | 71.4 | 0.0 | 71.4 | 100.0 | 100.0 | ||
X | 4 | R | 50.0 | 100.0 | 50.0 | 0.0 | 0.0 |
I | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 25.0 | 0.0 | ||
S | 50.0 | 0.0 | 50.0 | 75.0 | 100.0 | ||
I | 1 | R | 100.0 | 100.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
I | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | ||
S | 0.0 | 0.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | ||
29E | 7 | R | 85.7 | 100.0 | 85.7 | 0.0 | 0.0 |
I | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 28.6 | ||
S | 14.3 | 0.0 | 14.3 | 100.0 | 71.4 | ||
NG | 63 | R | 73.0 | 100.0 | 57.1 | 0.0 | 0.0 |
I | 0.0 | 0.0 | 8.0 | 11.1 | 7.9 | ||
S | 27.0 | 0.0 | 34.9 | 88.9 | 92.1 |
患者和健康携带者分离的菌株中均检测出对青霉素和氨苄西林不敏感的菌株,但没有耐药菌株出现。2种来源的菌株对萘啶酸、复方新诺明和环丙沙星等3种药物均有较高的耐药率。其中X群、Y群、I群、29E群和不可分群菌株对复方新诺明全部耐药,这些菌株中除1株X群分离自患者,其余均分离自健康带菌者。A群和W135群患者来源的菌株敏感率要高于健康携带者来源的菌株;而B群和C群的情况则相反。值得注意的是,健康携带者分离的W135群菌株中有45.8%(11/24)对复方新诺明耐药,但是患者来源的菌株对该药100%(8/8)敏感,见表3。
血清群 | 来源 | 菌株数 | 萘啶酸(%) | 复方新诺明(%) | 环丙沙星(%) | ||||||
R | I | S | R | I | S | R | I | S | |||
注:(1)以百分比表示菌株对抗生素敏感和耐药比例,“R”表示对抗生素耐药,“I”表示对抗生素不敏感,“S”表示对抗生素敏感,“带菌”表示健康携带者。 | |||||||||||
A | 患者 | 73 | 94.5 | 0.0 | 5.5 | 68.5 | 31.5 | 0.0 | 71.2 | 23.3 | 5.5 |
健康带菌者 | 29 | 96.6 | 0.0 | 3.4 | 96.6 | 3.4 | 0.0 | 82.8 | 13.8 | 3.4 | |
B | 患者 | 15 | 60.0 | 0.0 | 40.0 | 93.3 | 6.7 | 0.0 | 60.0 | 6.7 | 33.3 |
健康带菌者 | 61 | 49.2 | 1.6 | 49.2 | 96.8 | 1.6 | 1.6 | 44.3 | 1.6 | 54.1 | |
C | 患者 | 93 | 82.8 | 11.8 | 5.4 | 98.9 | 0.0 | 1.1 | 53.8 | 33.3 | 12.9 |
健康带菌者 | 102 | 82.4 | 3.9 | 13.7 | 86.3 | 8.8 | 4.9 | 16.7 | 53.9 | 29.4 | |
W135 | 患者 | 8 | 25.0 | 0.0 | 75.0 | 0.0 | 0.0 | 100.0 | 25.0 | 0.0 | 75.0 |
健康带菌者 | 24 | 50.0 | 0.0 | 50.0 | 45.8 | 4.2 | 50.0 | 45.8 | 4.2 | 50.0 | |
X | 患者 | 1 | 0.0 | 0.0 | 100.0 | 100.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
健康带菌者 | 3 | 66.7 | 0.0 | 33.4 | 100.0 | 0.0 | 0.0 | 66.7 | 0.0 | 33.4 | |
Y | 健康带菌者 | 7 | 28.6 | 0.0 | 71.4 | 100.0 | 0.0 | 0.0 | 28.6 | 0.0 | 71.4 |
29E | 健康带菌者 | 7 | 85.7 | 0.0 | 14.3 | 100.0 | 0.0 | 0.0 | 85.7 | 0.0 | 14.3 |
I | 健康带菌者 | 1 | 100.0 | 0.0 | 0.0 | 100.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
NG | 健康带菌者 | 63 | 73.0 | 0.0 | 27.0 | 100.0 | 0.0 | 0.0 | 57.1 | 8.0 | 34.9 |
20世纪80年代以来,流脑的发病率和病死率均明显下降,该传染病控制成效很大程度上归功于疫苗的使用,然而,抗生素的使用在降低病死率和控制疫情传播方面也起到了不容忽视的作用。但是,随着抗生素的广泛应用,Nm菌株的耐药现象逐渐凸显出来,而且,由于菌群结构的改变[6, 7, 8],其耐药的模式也会越来越复杂。本研究中发现,我国近10年分离的Nm菌株的抗生素敏感性因不同年份、不同血清群和不同来源表现各有差异,这种复杂的耐药模式对临床抗生素选用来说是一个挑战。
与国外监测情况相比,我国Nm菌株中未发现独有的抗生素耐药,对磺胺类(复方新诺明)、喹诺酮类(萘啶酸和环丙沙星)、青霉素类(青霉素和氨苄西林)等抗生素不敏感/耐药的现象在其他国家均已有报道[9, 10]。另外,本研究中未检测出利福平耐药菌株,但是鉴于国外已有报道[10],临床用药中仍需重视。
青霉素类药物一直作为治疗流脑的一线用药广泛用于流脑的防治,取得不错的效果[11];而本研究中发现,从2006年开始出现对青霉素类药物不敏感菌株2.4%(2/82)且有逐年增多之势。流脑菌株对这一类药物耐药性的改变,可能最终会导致流脑菌株对抗生素耐药谱的改变,从而改变我们目前的用药策略[12]。
我国Nm菌株的环丙沙星耐药率明显高于其他国家,分子分型和相关基因测序结果显示,高的耐药率与我国流行的克隆群紧密相关,而且不同克隆群形成耐药的机制也不相同[13]。前期研究发现我国健康人群分离的W135群菌株与患者来源的菌株基因特征不同[14],本研究中我们也发现,2种不同来源的W135群菌株对复方新诺明的耐药性明显不同,耐药性上和基因分型上所表现出的差异是否相关,尚不清楚,需要后续研究结果进行支持。另外,这些耐药菌株的耐药机制和其他血清群是否相同,也值得进一步研究。
总之,在近年来对Nm菌株的药敏监测结果显示,不同年份和不同血清群的分离自患者和健康携带者的菌株,对磺胺类和喹诺酮类药物都具有较高的耐药性,对青霉素类不敏感的菌株也在逐渐增多,虽未出现耐药菌株,但对青霉素的敏感性已经降低,应引起高度重视。由于磺胺类和喹诺酮类药物一直作为我国流脑预防控制用首选药物,青霉素类药物也在临床上广泛使用,因此根据细菌耐药监测结果来合理使 用抗菌药物,对降低流脑的发病率和病死率具有重要意义。加强对Nm的药物敏感性监测是一项长期而重要的工作。
[1] | Peltola H. Meningococcal disease: still with us[J]. Clin Infect Dis,1983,5(1):71-91. |
[2] | Jafri RZ, Ali A, Messonnier NE, et al. Global epidemiology of inv asive meningococcal disease[J]. Popul Health Metr,2003,11: 17. |
[3] | Xu L, Shao ZJ, Li MC, et al. Test on susceptibility of Neisseria meningitidis to 12 antimicrobial agents[J]. Chinese Journal of Vaccines and Immunization,2006,12(1):53-55.(in Chinese) 徐丽,邵祝军,李马超,等. 脑膜炎奈瑟菌对12种抗菌药物体外敏感性检测[J]. 中国计划免疫,2006,12(1):53-55. |
[4] | Zhang Q, Xu L, Shao ZJ. Antibiotic susceptibility of Neisseria meningitidis isolates in some areas in China,2008-2009[J]. Disease Surveillance,2010,25(4):282-285.(in Chinese) 张麒,徐丽,邵祝军. 2008-2009年中国部分地区脑膜炎奈瑟菌对体外抗生素敏感性检测[J]. 疾病监测,2010,25(4):282-285. |
[5] | Clinical Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 20th informational supplement[S]. CLSI document M100-S20. Wayne(PA):The Institute,2011. |
[6] | Shao ZJ, Xu L, Gao Y, et al. Epidemiologic trend of serogroup of Neisseria meningitidis strains in China[J]. Chinese Journal of Vaccines and Immunization,2007,13(6):541-544.(in Chinese) 邵祝军,徐丽,高源,等. 中国流行性脑脊髓膜炎流行菌群变化趋势分析[J]. 中国计划免疫,2007,13(6):541-544. |
[7] | Shao ZJ, Li W, Ren J, et al. Identification of a new Neisseria meningitidis serogroup C clone from Anhui province, China[J]. Lancet,2006,367(9508):419-423. |
[8] | Zhou H, Gao Y, Xu L, et al. Distribution of serogroups and sequence types in disease-associated and carrier strains of Neisseria meningitidis isolated in China between 2003 and 2008[J]. Epidemiol Infect,2012,140(7):1296-1303. |
[9] | Wu HM, Harcourt BH, Hatcher CP, et al. Emergence of ciprofloxacin-resistant Neisseria meningitidis in North America[J]. N Engl J Med,2009,360(9):886-892. |
[10] | Hedberg ST, Fredlund H, Nicolas P, et al. Antibiotic susceptibility and characteristics of Neisseria meningitidis isolates from the African meningitis belt,2000 to 2006: phenotypic and genotypic perspectives[J]. Antimicrob Agents Chemother,2009,53(4):1561-1566. |
[11] | Quagliarello VJ, Scheld WM. Treatment of bacterial meningtitis[J]. N Engl J Med,1997,336(10):708-716.331(8586):657-658. |
[12] | Sutcliffe EM, Jones DM, El-Sheikh S, et al. Penicillin-insensitive meningococci in the UK[J]. Lancet, 1988, 331(8586):657-658. |
[13] | Zhu B, Fan Y, Xu Z, et al. Genetic diversity and clonal characteristics of ciprofloxacin-resistant meningococcal strains in China[J]. J Med Microbiol,2014,63(Pt 11):1411-1418. |
[14] | Tian GZ, Shao ZJ, Li MC, et al. Using molecular techniques to study the genetic characterization of serogroup W135 Neisseria meningitidis isolated from China[J]. Chinese Journal of Epidemiology,2007: 28(9):926-927.(in Chinese). 田国忠,邵祝军,李马超,等. 中国7株W135群脑膜炎奈瑟菌基因特征分析[J]. 中华流行病学杂志,2007,28(9):926-927. |