肠球菌广泛存在于人和动物消化道内，以粪肠球菌、屎肠球菌最为常见，其次为鹑鸡肠球菌、钻黄肠球菌。肠球菌是重要的机会感染菌，当机体免疫力下降时可致病^{[1, 2]}。近年来，肠球菌成为重要的院内感染病原菌，其对多种抗菌药物具有耐药性，特别是对万古霉素的天然或获得性耐药能力，大大增加了肠球菌感染的控制难度^{[3, 4]}。肠球菌对万古霉素耐药基因主要有vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3，vanA、vanB为介导万古霉素高水平耐药的获得性耐药基因，vanC1、vanC2/C3可介导万古霉素低水平耐药^{[3, 4, 5]}。

本研究针对肠球菌属、粪肠球菌、屎肠球菌、vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3保守基因选用合适引物，建立多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction，MPCR)方法，同时检测肠球菌属和2个常见肠球菌种及4个常见万古霉素耐药基因型，方法准确快速，为肠球菌感染的诊断治疗提供科学手段，有利于万古霉素耐药肠球菌(vancomycin-resistant Enterococci，VRE)的监测及其流行传播的有效控制。

vanA型屎肠球菌标准菌株ATCC 700221、vanB型粪肠球菌标准菌株ATCC 51299购于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)；vanC1型鹑鸡肠球菌标准菌株ATCC 49673、vanC2/3型钻黄肠球菌标准菌株ATCC 49673、万古霉素敏感屎肠球菌ATCC 19434、万古霉素敏感粪肠球菌ATCC 19433、坚韧肠球菌ATCC 19432以及鸟肠球菌ATCC 14025购于中国科学院微生物所菌种保藏中心；13株非肠球菌属细菌：李斯特菌、乳房链球菌、溶血链球菌、咽峡链球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌均为本实验室保存的临床来源菌株。

57株人源检测菌株来自临床医院；41株动物源检测菌株分离于动物(猪、鸡)粪便样本(选用含8 μg/ml万古霉素的肠球菌筛选培养基进行分离培养)。检测菌株菌种鉴定结果均来自于VITEK Compact 60自动微生物鉴定仪；检测菌株的万古霉素和替考拉宁药敏结果来自于琼脂稀释法药敏检测实验。

脑心浸液琼脂培养基、肠球菌选择性培养基(叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂)购自北京陆桥生物技术有限公司；MPCR试剂盒(QIAGEN^® Multiplex PCR Kit)购自德国Qiagen公司；所需引物合成于北京天一辉远生物科技有限公司；电泳所需Marker(100 bp DNA Ladder)购于宝生物工程(大连)有限公司。

按照Qiagen MPCR试剂盒要求进行。具体如下：MPCR体系50 μl，2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix(包括HotSta Taq^® DNA Polymerase，Multiplex PCR Buffer，dNTP Mix) 25 μl，RNase-free water 3 μl，每种引物(10 μmol/L)上下游各1 μl，10×Coral Load Dye 5 μl，Template DNA(≤100 ng/μl) 1 μl；反应条件：95 ℃预变性15 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，35个循环，65 ℃终延伸10 min。

采用改良的水煮法对菌株进行DNA提取。具体方法：挑取适量37 ℃培养16~18 h的培养菌株菌体到700 μl 1×TE缓冲液中，充分振荡混匀，常温下14 000 r/min离心4 min，彻底去除上清，如此重复2次后再加入新的TE缓冲液150 μl，彻底混悬，置于100 ℃水浴中15 min，立即放入冰浴中10 min，4 ℃、14 000 r/min离心 3 min，轻轻吸取上清并转移至新的离心管中，-20 ℃以下保存备用^[6]。

选择分别针对肠球菌属、粪肠球菌、屎肠球菌及4个万古霉素耐药基因型(vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3)保守基因的多对特异性引物进行多重PCR试验，最终选用能够扩增出相应特异性条带，且不同产物条带大小能够区分的引物作为本MPCR方法引物。同时选用针对16S rDNA的通用引物作为MPCR体系的内参基因引物。MPCR方法选用引物详见表1。

取MPCR产物3.5 μl上样于2%的琼脂糖凝胶上，Marker为100 bp ladder，电泳参数：电压100 V，时间45 min。电泳结束后放置紫外灯下照射成像。

采用改良的水煮法对98株检测菌株进行DNA提取，应用建立的MPCR方法对检测菌株进行菌种鉴定及万古霉素耐药基因型检测。将MPCR方法检测结果与VITEK Compact 60自动微生物鉴定仪菌种鉴定结果及琼脂稀释法的万古霉素、替考拉宁药敏检测结果比较，分析其一致性。

MPCR扩增产物特异性好，片段大小合适能够分辨，见图1。泳道1有4条带，自上至下依次为16S rDNA的阳性条带、屎肠球菌特异性条带、vanA基因条带、肠球菌属的特异性条带，该菌为vanA型屎肠球菌标准菌株ATCC 700221；泳道2有4条带，自上至下依次为16S rDNA的阳性条带、粪肠球菌特异性条带、vanB基因条带、肠球菌属的特异性条带，该菌为vanB型粪肠球菌标准菌株ATCC 51 299；泳道3有3条带，自上至下依次为16S rDNA的阳性条带、vanC1基因条带、肠球菌属的特异性条带，该菌为鹑鸡肠球菌标准菌株ATCC 49673；泳道4有3条带，自上至下依次为16S rDNA的阳性条带、vanC2/C3基因条带、肠球菌属的特异性条带，该菌为钻黄肠球菌标准菌株ATCC 49673；泳道5有3条带，自上至下依次为16S rDNA的阳性条带、粪肠球菌特异性条带、肠球菌属的特异性条带，该菌为万古霉素敏感的粪肠球菌标准菌株ATCC 19433；泳道6有3条带，自上至下依次为16S rDNA的阳性条带、屎肠球菌特异性条带、肠球菌属的特异性条带，为万古霉素敏感的屎肠球菌参考菌株ATCC 19434；泳道7、8均有2条带，自上至下依次为16S rDNA的阳性条带、肠球菌属的特异性条带，分别为坚韧肠球菌标准菌株ATCC 19432、鸟肠球菌标准菌株ATCC 14025；泳道9~21均有1条16S rDNA的阳性条带，分别对应李斯特菌、乳房链球菌、溶血链球菌、咽峡链球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌13株非肠球菌属细菌；泳道22无阳性条带，是未加DNA模板的阴性对照。

图 1 参考菌株的多重PCR扩增凝胶电泳结果 Fig.1 Agarose gel electrophoresis of reference strains by multiplex PCR 注：M，Marker，条带大小(bp)由上至下依次为1500，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100。

图选项

MPCR方法对98株检测菌株菌种鉴定及万古霉素耐药基因型检测结果：98株检测菌株均为肠球菌，粪肠球菌18株，屎肠球菌38株，未能鉴定到种的肠球菌42株；vanA基因型阳性菌株6株，vanB基因型阳性菌株0株，vanC1基因型阳性菌株6株，vanC2/C3基因型阳性菌株32株，万古霉素耐药基因阴性菌株54株。MPCR方法与VITEK Compact 60自动微生物鉴定仪对98株检测菌株菌种鉴定结果相一致；MPCR方法检测98株菌万古霉素耐药基因型与药敏检测其耐药表型相对应：6株携带vanA基因屎肠球菌对万古霉素和替考拉宁均表现高水平耐药；携带vanC1或vanC2/C3肠球菌对万古霉素中介耐药，对替考拉宁敏感；未检测出万古霉素耐药基因的肠球菌对万古霉素和替考拉宁均敏感，检测菌株耐药基因型与药敏检测结果见表2。部分检测菌株MPCR扩增凝胶电泳图见图2。

近年来，肠球菌引起的人与动物感染率逐渐上升，成为人兽共患的重要机会感染菌。引起感染的肠球菌以粪肠球菌和屎肠球菌最为多见，有些抗菌药物对粪肠球菌和屎肠球菌敏感性差别较大，控制肠球菌感染应考虑感染肠球菌菌种而选用相应敏感的抗菌药物^{[1, 5, 8]}。目前，临床常用糖肽类抗菌药物(包 括万古霉素和替考拉宁)治疗其他抗菌药物耐药的革兰阳性菌引起的感染，万古霉素耐药肠球菌(VRE)自1986年报道以来，其分离率逐年增加且在世界各地均有出现，给临床治疗带来巨大挑战^{[3, 4]}。肠球菌对万古霉素的耐药机制主要在于细菌细胞壁肽聚糖前体5肽侧链末端D-丙氨酰D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)发生改变，药物与之亲和力降低，细胞壁合成不再被抑制而耐药，肠球菌对耐药基因有vanA、vanB、vanC1、vanC2/C3、vanG、vanH等，vanA基因除介导万古霉素高水平耐药外还介导替考拉宁的高水平耐药，常见于屎肠球菌中；vanB基因除介导万古霉素高水平耐药处不能介导替考拉宁耐药，在粪肠球菌和屎肠球菌均有分布；本次MPCR方法检测vanC1阳性菌株VTIEK鉴定均为鹑鸡肠球菌，未在非鹑鸡肠球菌中扩增出vanC1条带，vanC1为鹑鸡肠球菌天然携带的介导万古霉素低水平耐药的基因，最近有学者报道在非鹑鸡肠球菌发现vanC1基因^{[3, 4, 5, 12]}；vanC2/C3为钻黄肠球菌/微黄肠球菌天然携带的介导万古霉素低水平耐药的基因，钻黄肠球菌较微黄肠球菌更为常见^[13]，本次MPCR方法检测vanC2/C3阳性菌株VTIEK鉴定均为钻黄肠球菌，未在非钻黄肠球菌中扩增出vanC2/3条带；vanC1与vanC2/C3以往分别作为鹑鸡肠球菌和钻黄肠球菌的种特异性序列鉴定相应肠球菌种；vanG和vanH比较少见^{[3, 5]}。不同耐药基因介导万古霉素耐药水平不同，不同种属肠球菌携带万古霉素耐药基因型及携带率也有差别，明确VRE的万古霉素耐药基因型，可有针对性的选择抗菌药物从而有效控制VRE感染及传播。

图 2 检测菌株的MPCR扩增凝胶电泳结果(部分) Fig.2 Agarose gel electrophoresis of detected strains by multiplex PCR(part) 注：1-1~1-2.屎肠球菌(不含万古霉素耐药基因)； 1-3~1-8.屎肠球菌(含vanA)； 1-9.未加模板的阴性对照； 1-M~2-M.Marker； 2-1~2-5.粪肠球菌(不含万古霉素耐药基因)； 2-6.vanC2/C3； 2-7~2-8.粪肠球菌(不含万古霉素耐药基因)； 3-M.Marker； 3-1.vanC1； 3-2.vanC2/C3； 3-3~3-4.vanC1； 3-5~3-6.vanC2/C3； 3-7~3-8.未鉴定到种的肠球菌(不含万古霉素耐药基因)。

图选项

目前肠球菌菌种鉴定方法主要有传统的生化鉴定法、API生化板条、微生物自动鉴定仪等，对于VRE检测方法主要依赖药敏表型检测及万古霉素耐药基因的单重聚合酶链反应方法，均存在不同的优缺点，如：传统生化鉴定法结果准确可信赖，但操作步骤相对繁琐；微生物自动鉴定仪操作相对简单，但价格较昂贵；依赖药敏表型的VRE检测方法仅能得到菌株对药物耐受水平值，但不能获取其耐药基因型从耐药机制角度鉴别VRE^{[14, 15]}。本实验创立的MPCR方法对肠球菌属和常见肠球菌种及万古霉素耐药基因型进行同时检测，种属鉴定结果与VITEK菌种鉴定结果一致；万古霉素耐药基因型检测与药敏检测其耐药表型相对应。说明本方法能够准确、方便、快速鉴定肠球菌种属及万古霉素耐药基因型，成本较低。以往也有学者应用MPCR检测肠球菌种属或万古霉素耐药基因型，但一般MPCR体系中引物对较少^{[3, 7, 16]}，本实验选用包含一对MPCR体系的内参对照引物(27F，1492R)在内的8对引物，能够同时检测肠球菌属和2个常见肠球菌菌种及4个万古霉素耐药基因型，更加高效、准确。本方法可用于人及动物源肠球菌种属鉴定及VRE筛选，这对于肠球菌菌种分布情况调查以及VRE有效监测控制具有重要意义。