下呼吸道感染是医院内外感染的一种重要类型，而老年下呼吸道感染病情严重，病死率高。目前，随着临床上广谱抗菌药物的广泛应用，尤其是第三代头孢菌素的滥用，其耐药问题日趋严重，其中常见的耐药机制是由质粒介导的C类头孢菌素β-内酰胺酶(AmpC酶)，该酶几乎不被β-内酰胺酶所抑制，并能水解β-内酰胺类抗菌药物，尤其是头孢菌素，已引起国内外临床医师的广泛关注。为了解下呼吸道感染肺炎克雷伯菌质粒介导产AmpC酶的发生情况，对2013年1 12月临海市中医医院呼吸内科老年住院患者下呼吸道标本中分离的97株肺炎克雷伯菌进行了耐药基因定位和分型研究，现报道如下。

临床菌株分离自临海市中医医院呼吸内科2013年1 12月老年住院患者下呼吸道感染标本中分离的97株肺炎克雷伯菌(不包括同一患者多次分离的同种细菌)。标本采集方法；采用一次性吸痰管吸取下呼吸道痰标本，或晨起留取痰标本前2~6 h禁食，用生理盐水漱口3次后，以深咳痰或用无菌棉棒取咽分泌物标本于无菌器皿内。取得标本后立即送检。其中男性57例，女性42例，年龄60~89岁，平均72.7岁。质控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC 700603为AmpC酶阴性对照，阴沟肠杆菌029M为产AmpC酶阳性对照。

MH琼脂、MH肉汤、血培养基、麦康凯培养基等购自杭州天和微生物试剂公司，所有药敏纸片均为英国OXOID公司产品；UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒、聚合酶链反应(PCR)产物纯化试剂盒为上海生工生物技术有限公司产品；AmpC酶PCR 5对引物由上海生工生物工程技术有限公司合成；Marker (DL 500)为TaKaRa公司产品。VITEK-60型全自动细菌鉴定仪为法国生物梅里埃公司产品；HRSP 0520 PCR扩增仪为美国Thermo Hybaid公司产品，Puwer Pac 300型电泳仪为美国Bio-Rad公司产品，凝胶成像仪为上海天能公司产品。

 细菌分离鉴定参照《全国临床检验操作规程》进行，并使用法国生物梅里埃公司VITEK-60型全自动细菌鉴定仪。

按CLSI 2010推荐的K-B纸片扩散法标准^[1]操作。将0.5麦氏单位待测菌株的菌液均匀涂布于M-H琼脂平板，中间贴上头孢西丁(30 μg/片)纸片，35 ℃培养过夜，诊断标准以抑菌圈≤18 mm表示待测菌株对头孢西丁耐药，疑为产AmpC酶菌株。阴性对照采用肺炎克雷伯菌ATCC 700603菌株，阳性对照采用阴沟肠杆菌029M菌株。

采用双纸片表型确证法^[2]，在空白的无菌纸片和头孢西丁纸片上各加入40 g/L的邻氯西林2.5 μl，风干备用，然后将疑产AmpC酶菌株转种于M-H肉汤中，35 ℃恒温摇床200 r/min振荡培养6～12 h，调整浓度为0.5麦氏单位，涂布于M-H平板上，贴上邻氯西林、头孢西丁和加有邻氯西林的头孢西丁纸片各1张，35 ℃恒温培养18 h后观察结果。若加入邻氯西林的头孢西丁纸片抑菌圈直径比其他2个纸片的抑菌圈都扩大5 mm以上者为阳性。

对确证产AmpC酶的菌株严格按上海生工生物技术有限公司UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒说明书进行提取耐药质粒。质粒提取质量的检测用1%琼脂凝胶电泳鉴定。

PCR：根据质粒AmpC酶基因的分群设计群特异性的5对引物，采用PCR扩增其基因型。PCR引物设计参照Pérez-Pérez和Hanson^[3]的方法。5对引物序列和目标长度见表 1。PCR反应体系及参数：PCR反应体系总体系50 μl。反应条件：10×缓冲液 5 μl，dNTPs混合液(2.5 mmol/L)4 μl，上下游引物(25 μmol/L)各1 μl，模板1 μl，Taq酶0.5 μl；反应条件：93 ℃预变性2 min，94 ℃变性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，重复35个循环，最后一个72 ℃延长至5 min。取PCR产物5 μl在1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色紫外灯下成像，观察分析结果。

 将PCR扩增后产物交上海生工生物技术有限公司进行纯化、测序，测序使用双脱氧末端终止法，在ABI PRISMTM377自动测序仪上进行，测序结果经DNAstar 7.1软件接拼，与GenBank中的BLAST程序进行比对分析，确定其基因型。

扩增出质粒AmpC酶基因的菌株作为供体菌，耐药利福平的大肠埃希菌C 600为受体菌，将二菌分别培养至对数生长期后等量混匀，再接种到含100 μg/ml利福平、10 μg/ml头孢西丁的麦康凯培养基上，置35 ℃培养16~18 h后观察结果。不利用乳糖的菌落才是接合子，并对所有接合子用PCR确认是否含有质粒AmpC基因。

老年住院患者下呼吸道感染标本中分离的97株肺炎克雷伯菌经头孢西丁敏感试验，筛选出可疑产AmpC酶菌株共21株，初筛阳性率为21.6%。对头孢西丁敏感试验筛选出疑产AmpC酶的菌株再经双纸片表型确证试验，结果有17株阳性，确证产AmpC酶菌株检出率为17.5%。

17株双纸片表型确证试验确证产AmpC酶阳性的肺炎克雷伯菌进行质粒DNA提取，PCR检测AmpC酶基因，琼脂糖电泳显示，17株均以DHA20150508组引物扩增后得到与预期片段大小一致的片段(405 bp)，见图 1。

图 1 DHA-120150508型PCR产物电泳结果 Fig.1 Electropherogram of PCR products of AmpC-β lactamase gene DHA-1 注：N：阴性对照； 1~5：DHA-120150508阳性株； 6：阳性对照； M：Marker

图选项

 17株肺炎克雷伯菌PCR阳性的菌株再经相应特异性引物进行全长基因扩增，其中以DHA20150508为引物的17株菌株全部与引物DHA20150508扩增出约405 bp的阳性条带，通过GenBank中对应序列比对，属DHA-120150508基因型。

17株双纸片表型确证法试验阳性菌株和受体菌(大肠埃希菌C600)混合生长选择出的菌落，用含利福平和头孢西丁的麦康凯培养基对接合子进行第一次筛选，17株AmpC筛选出阳性菌株均将头孢西丁的耐药基因传递给受体菌大肠埃希菌C600，共得到17株不同的接合子。再用含头孢他定、头孢噻肟、克拉维酸、利福平的麦康凯培养基对这17株接合子进行第二次筛选，同样得到17株接合子，表明接合成功。

AmpC酶是目前被国内外微生物学专家关注的β-内酰胺酶之一，由于产持续高产AmpC酶菌株逐年增多，已造成临床抗感染治疗的困难。AmpC酶主要是由革兰阴性杆菌的染色体或质粒编码产生，主要作用于头孢菌素类抗菌药物，且不被克拉维酸抑制的“丝氨酸”头孢菌素酶，特点是对头霉烯类抗菌药物呈高水平耐药^[4]。AmpC酶从基因表达来源可分为染色体介导和质粒介导2种，前者基因位于细菌染色体上，通常表现为低水平表达，诱导剂可诱导其表达，而质粒型AmpC酶的基因位于质粒上，不需要诱导即可产生大量AmpC酶^[5]。克雷伯菌属是天然缺乏ampC20150508基因的菌株，因此，从肺炎克雷伯菌中检测到的AmpC酶，大多由其染色体外遗传物质质粒引入基因编码而产生AmpC酶，由于质粒DNA具有传递的特点，可通过转化、接合、转导、转座子等各种途径在细菌间传递，引起医院感染或流行^{[5, 6]}。因此，从肺炎克雷伯菌中检测AmpC酶具有更为重要的临床意义。

从本次实验结果来看，97株实验菌株中经头孢西丁敏感试验筛选出可疑产AmpC酶菌株21株，初选阳性率为21.6%。可疑阳性菌株再经双纸片表型确证试验结果有17株确证产AmpC酶，阳性率为17.5%。17株确证产AmpC酶菌株通过质粒DNA提取，PCR检测，琼脂糖电泳显示，17株均与DHA20150508引物扩增后得到大小一致的片段(405 bp)。此结果与本地区报道的检出率15.56%和20.65%基本相同^{[6, 7]}，低于河南省报道的检出率57.68%^[8]。可能与不同地区抗菌药物使用不一或与检测方法不同有关。本实验还对17株确证产AmpC酶的菌株进行质粒DNA提取，PCR扩增检测基因型，PCR结果显示：17株菌株均扩增出约405 bp的特异性条带，其扩增产物与美国GenBank基因库中的AmpC酶基因序列比对，与DHA-120150508型基因序列100%同源。表明临海市中医医院AmpC酶流行基因型主要为DHA-120150508型。分析DHA-120150508型在该院检出率较高的原因除了在本地区为主要流行型以外，另一原因与老年患者免疫力低下，且身患多种疾病住院频繁，住院时间长，抗菌药物大量使用，细菌易以飞沫或气溶胶的形式造成医院内交叉感染有关。由于质粒DNA具有可传递的特点，本研究还将从肺炎克雷伯菌质粒中检测的AmpC基因，经接合试验证实可通过接合方式传递至受体菌，提示该菌质粒携带的AmpC基因可能在临床菌株间的传递及导致耐药性播散中起重要作用。

本实验中，通过表型筛选得到耐头孢西丁耐药株为21株，通过产AmpC酶确证试验及引物PCR扩增确定产AmpC酶菌株为17株。由此表明，表型与基因型的结果有一定的关联但也同时存在差异，可能与肺炎克雷伯菌细胞对药物的通透性降低有关^[9]，也可能由于转入了ampR20150508基因，使ampC20150508基因呈诱导型表达，或由于所产生的AmpC酶量活力较低，或其他的耐药机制导致的耐药，将在以后的实验中进行深入研究。